分子生物學(xué)復(fù)習(xí)

第一章緒論分子生物學(xué)的研究對(duì)象是核酸和蛋白質(zhì)大分子的結(jié)構(gòu)與功能以核酸為中心，研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的規(guī)律、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的現(xiàn)象等，從分子水平了解生命活動(dòng)的本質(zhì)主要研究?jī)?nèi)容：核酸、蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能及細(xì)胞信號(hào)傳到與通訊等艾滋病研究艾滋?。韩@得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS),是有艾滋病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的一種傳染性疾病。HIV是由包膜蛋白gp120與CD4T淋巴細(xì)胞表面的CD4受體結(jié)合后，在gp41透膜蛋白的協(xié)助下，伸入CD4+細(xì)胞膜，將病毒基因注入細(xì)胞內(nèi)。HIV是單鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒，其基因組含有9747bp的核酸含有兩個(gè)亞型：HIV1、HIV2由20面體構(gòu)成，表面的糖蛋白呈刺突樣分部，直徑約為100nm雞尾酒療法(combinationtherapy)：美籍華裔何大一提出的綜合治療的方法，即聯(lián)合使用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療目前已經(jīng)上市的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的核甘類(lèi)藥物：齊多夫定、去羥肌昔等；非核昔類(lèi)藥物：奈韋拉平、地拉韋啶、Efavirenz等第二章核酸核酸(nucleicacid)是以核甘酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)：主要以雙鏈結(jié)構(gòu)形式存在，90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于核外如線粒體，葉綠體，質(zhì)粒等。攜帶遺傳信息，決定細(xì)胞和個(gè)體的基因型(genotype)。核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)：常以單鏈形式存在分布于胞核、胞液。參與細(xì)胞內(nèi)DNA遺傳信息的表達(dá)。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。DNA的復(fù)制1953年，Watson和Crick提出了遺傳物質(zhì)復(fù)制的詳細(xì)假說(shuō)：半保留復(fù)制(semiconservativereplication)1958年，Meselson和Stahl利用同位素標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制。DNA的復(fù)制體系DNA復(fù)制是一個(gè)十分復(fù)雜的生物合成過(guò)程，需要30多種酶和蛋白質(zhì)參與。每個(gè)DNA復(fù)制的獨(dú)立單元被稱(chēng)為復(fù)制子(replicon)，主要包括復(fù)制起始位點(diǎn)(originofreplication^^終止位點(diǎn)(terminus)。整個(gè)DNA復(fù)制“機(jī)器”被稱(chēng)為DNA復(fù)制體系(DNAreplicasesystem或DNAreplisome)。DNA聚合酶DNA聚合酶的定義：以DNA為復(fù)制模板，將DNA由5’端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3’端的酶。DNA聚合酶以4種脫氧核甘磷酸為底物，還需要模板DNA、引物和Mg2+。DNA聚合酶催化合成反應(yīng)的機(jī)制：在生長(zhǎng)的DNA鏈(或引物鏈)末端的3,-OH對(duì)另一新加入的脫氧核甘三磷酸a-位的磷酸進(jìn)攻，形成磷脂鍵，并放出一個(gè)焦磷酸。每放出一個(gè)焦磷酸，即形成一個(gè)磷酸二酯鍵，就延長(zhǎng)一個(gè)核甘酸單位的DNA鏈。原核生物中的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶I?V(polI?V)。前三種酶具有多種酶活性的多功能酶，參與原核生物DNA復(fù)制的酶主要是polIII和polIopolI是1956年由A.Kornberg等在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，也是研究最為深入的一種DNA聚合酶。poll為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量為109000,是一個(gè)多功能酶，具有5'-3'聚合酶、3'-5'外切酶和5'f3'外切酶活性?？杀惶禺惖牡鞍酌杆鉃閮蓚€(gè)片段，其中的大片段稱(chēng)為Klenowfragment,具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶的活性polll為多亞基酶，它有5'-3'聚合酶和3'-5'外切酶活性，但沒(méi)有5'-3'外切酶活性，且酶活性很低，目前認(rèn)為其主要參與DNA的修復(fù)。polin由十種亞基組成，其中a亞基具有5/-3/聚合DNA的酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而&亞基具有3,-5’外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。polW和V是1999年被發(fā)現(xiàn)，涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(error-pronerepair)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性(accuracy),因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。DNA解旋酶(gyrase)天然DNA的負(fù)超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進(jìn)行，復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA解旋酶去除接連產(chǎn)生的扭曲張力。大腸桿菌中的DNA解旋酶又稱(chēng)拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topoisomeraseII,TopII),有四個(gè)亞基組成四聚體a282。真核生物拓?fù)洚悩?gòu)酶I呈a8二聚體結(jié)構(gòu)。在消耗ATP時(shí)，DNA解旋酶每作用一次產(chǎn)生2個(gè)負(fù)超螺旋，可以消除復(fù)制叉向前移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋；在無(wú)ATP時(shí)，可同時(shí)切開(kāi)超螺旋的兩條鏈，使DNA變成松弛狀態(tài)，然后將切口接好，使復(fù)制的進(jìn)行不會(huì)因螺旋的纏結(jié)而被妨礙。DNA旋轉(zhuǎn)酶對(duì)真核細(xì)胞有絲分裂也是非常重要，如果不解開(kāi)纏繞，在任何細(xì)胞周期中姐妹染色體都將無(wú)法分離。此外，DNA旋轉(zhuǎn)酶在轉(zhuǎn)錄、同源重組及可移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)座中都起重要作用。DNA解鏈酶(DNAhelicase)和單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)DNA解鏈酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白的功能：DNA在被復(fù)制前都必須解開(kāi)雙鏈，復(fù)制過(guò)程中，復(fù)制叉在不斷前進(jìn)，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)制能夠順利進(jìn)行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定狀態(tài)。DNA解鏈酶和單鏈DNA結(jié)合蛋白承擔(dān)了這一任務(wù)。DNA解鏈酶是利用ATP水解獲得的能量來(lái)打斷氫鍵，解開(kāi)雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類(lèi)酶的總稱(chēng)(又稱(chēng)解螺旋酶)。原核生物大腸桿菌有4種解鏈酶，即I、n、n和Rep蛋白，其中Rep蛋白是最主要的，結(jié)合于前導(dǎo)鏈模板沿3’5’方向移動(dòng)，解鏈酶I、n、n結(jié)合于滯后鏈模板沿5’3’方向前進(jìn)，每解開(kāi)一對(duì)堿基需水解2分子ATP。單鏈結(jié)合蛋白(SSB)：能使雙螺旋解開(kāi)后的DNA單戀穩(wěn)定存在，便于以其為模板復(fù)制子鏈，保護(hù)單鏈DNA,避免核酸酶的降解。大腸桿菌中的SSB為四聚體，對(duì)單鏈DNA有很好的親和性，但對(duì)雙鏈DNA和RNA沒(méi)有親和力。它們與DNA結(jié)合時(shí)有正協(xié)同作用，即有一個(gè)SSB與DNA結(jié)合后，促進(jìn)了更多的SSB與DNA單鏈結(jié)合，直至迅速擴(kuò)展分布整個(gè)DNA單鏈。真核生物的SSB沒(méi)有正協(xié)同作用，可能作用方式有所不同。SSB有某些堿基組成的傾向性，但很少有順序?qū)Ｒ恍越Y(jié)合，可以周而復(fù)始地循環(huán)使用，在DNA的修復(fù)和重組中都有SSB的參與。隨著解旋酶的移動(dòng)和雙鏈的打開(kāi)，DNA鏈中的張力變小了。在將實(shí)驗(yàn)結(jié)論與兩種理論預(yù)言進(jìn)行比較后，科學(xué)家確定，解旋酶在這一過(guò)程中是主動(dòng)起作用的。引發(fā)酶(primerase,或稱(chēng)引物酶)已經(jīng)證明，DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3，端向前延伸。RNA引物的大小，通常為1—10個(gè)核甘酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。引物長(zhǎng)度和序列隨著基因組的種類(lèi)而表現(xiàn)出不同催化RNA引物(RNAprimer)合成的酶叫引發(fā)酶(primerase,或稱(chēng)引物酶)。引發(fā)酶識(shí)別DNA單鏈模板特意順序，以核糖核甘三磷酸(NTP)為底物合成寡聚核甘酸產(chǎn)生3，-OH,為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。引物與典型的RNA(如mRNA)不同，它們?cè)诤铣梢院蟛⒉慌c模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。E?coli的引發(fā)酶是一條肽鏈，相對(duì)分子量為60000,每個(gè)細(xì)胞中有50?100個(gè)分子，由大腸桿菌DnaG基因編碼。DNA連接酶(DNAligase)DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來(lái)。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH,而另一段DNA片段具有5--Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能?？偨Y(jié)：DNA復(fù)制體系：DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA解鏈酶、單鏈結(jié)合蛋白、引發(fā)酶、DNA連接酶原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程以大腸桿菌為例，說(shuō)明原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程。大腸桿菌DNA復(fù)制是一個(gè)十分復(fù)雜的生物合成過(guò)程，需要有20多種酶和蛋白質(zhì)因子參與，根據(jù)反應(yīng)階段和所需的不同酶類(lèi)，DNA的復(fù)制可被分為三個(gè)階段，即復(fù)制起始、延伸和終止。復(fù)制起始階段(1)復(fù)制起始點(diǎn)定義：DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核甘酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)(復(fù)制子)(originofreplication,ori)。大腸桿菌的復(fù)制起始位點(diǎn)是oriC,全長(zhǎng)245bp，所有細(xì)菌復(fù)制起始位點(diǎn)序列都是保守的，并富含AT。起始位點(diǎn)中有兩個(gè)關(guān)鍵序列在復(fù)制起始之中起作用：4個(gè)9bp的重復(fù)序列和3個(gè)13bp重復(fù)序列。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開(kāi)始就會(huì)連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開(kāi)始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位成為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，即只有一個(gè)復(fù)制子。(2)復(fù)制方向DNA的兩條鏈在起始點(diǎn)分開(kāi)形成叉子形狀，成為復(fù)制叉(replicationfork)。大多數(shù)復(fù)制方向是雙向的，少數(shù)是單向的三種形式定點(diǎn)開(kāi)始雙向復(fù)制，這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個(gè)定點(diǎn)位點(diǎn)解鏈，沿著兩個(gè)相反的方向個(gè)生長(zhǎng)出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制泡。定點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制，質(zhì)粒ColE1是個(gè)典型的例子，復(fù)制從一個(gè)起始點(diǎn)開(kāi)始，以同一方向生長(zhǎng)出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉。兩點(diǎn)開(kāi)始單向復(fù)制，腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個(gè)起點(diǎn)開(kāi)始的，形成兩個(gè)復(fù)制叉，各以一個(gè)單一方向復(fù)制出一條新鏈。⑶DNA復(fù)制起始的識(shí)別和雙鏈的解開(kāi)復(fù)制起始點(diǎn)具有的特定結(jié)構(gòu)(4個(gè)9bp的重復(fù)序列)能被DnaA蛋白辨認(rèn)結(jié)合，DnaB蛋白具有解螺旋作用，DnaC蛋白是DnaB蛋白結(jié)合于起始點(diǎn)，DNA雙鏈局部被打開(kāi)，引物酶和其他蛋白加入形成引發(fā)體。(4)引物的合成引發(fā)體的移動(dòng)方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向一致，移動(dòng)到能夠到一定位置即可引發(fā)RNA引物的合成，移動(dòng)和引發(fā)均需ATP提供能量。引發(fā)體中的引發(fā)酶催化合成一個(gè)低聚RNA引物，由引物提供3'-OH,使復(fù)制開(kāi)始進(jìn)行。前導(dǎo)鏈和滯后鏈均由引物酶合成引物，滯后鏈在復(fù)制中需要多次合成引物。引物的第一個(gè)核甘酸通常是pppA,個(gè)別為pppG,其長(zhǎng)度約為10個(gè)核甘酸。整個(gè)DNA復(fù)制過(guò)程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。復(fù)制起始可能還受ATP水解過(guò)程調(diào)控，因?yàn)镈naA只有與ATP相結(jié)合時(shí)才能與oriC區(qū)DNA結(jié)合。DNA復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂的間期和減數(shù)第一次分裂前的間期。DNA復(fù)制的不同方式1、DNA復(fù)制時(shí)大多是雙向進(jìn)行，形成兩個(gè)復(fù)制叉或生長(zhǎng)點(diǎn)。也有單向的，只形成一個(gè)復(fù)制叉或生長(zhǎng)點(diǎn)。2、對(duì)稱(chēng)復(fù)制：兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制。不對(duì)稱(chēng)復(fù)制：一條鏈復(fù)制后再進(jìn)行另一鏈的復(fù)制。環(huán)形DNA復(fù)制時(shí)在顯微鏡下可以看到形如眼形的。型結(jié)構(gòu)。3、P25圖2-9顯示了DNA不同復(fù)制方式。人：。型單向8：。型雙向C：直線雙向 D：多起點(diǎn)雙向E：滾動(dòng)環(huán)F：D環(huán)G：2D-環(huán)。4、細(xì)菌DNA復(fù)制叉移動(dòng)速度大約為5萬(wàn)bp/分，E.coli完成復(fù)制40分鐘，在豐富培養(yǎng)基中20分鐘即可分裂一次。DNA鏈的延伸大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過(guò)程靠DNAPolIII起作用，按照與模板堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，在polIII的作用下，逐個(gè)加入脫氧核糖核酸，使DNA鏈延長(zhǎng)。DNApolI的即時(shí)校讀、polIII的堿基選擇功能，使復(fù)制具有保真性，而DNAPolII在DNA修復(fù)中起作用。DNA雙鏈?zhǔn)欠较蚱叫械模趶?fù)制叉解開(kāi)的DNA模板鏈?zhǔn)?’f3,方向，另一條是3‘一5,方向，而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5‘f3,。為了解釋DNA的兩條鏈能夠同時(shí)復(fù)制，日本學(xué)者岡崎(Okazaki)等提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuousreplication膜型。定義：在DNA復(fù)制過(guò)程中，以3'f5'鏈為模板時(shí)，新生的DNA鏈以57-3,方向連續(xù)合成，鏈合成方向與解鏈方向一致，成為前導(dǎo)鏈；而以57一37鏈為模板合成方向互補(bǔ)的新鏈時(shí)，只能先合成小片段DNA(崗崎片段)，然后再由連接酶將多個(gè)岡崎片段連成完整的新鏈，這一新鏈的合成方向與解鏈方向相反，且合成是不連續(xù)進(jìn)行的，故稱(chēng)為滯后鏈。這種復(fù)制方式稱(chēng)之為半不連續(xù)復(fù)制。由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開(kāi)的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱(chēng)為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000?2000個(gè)核甘酸，而在真核生物中約為100個(gè)核甘酸。DNA鏈的終止大腸桿菌為環(huán)狀雙鏈DNA,雙向復(fù)制，它的兩個(gè)復(fù)制叉的匯合點(diǎn)就是復(fù)制的終止位點(diǎn)(terminusregion,ter)。當(dāng)子鏈延伸達(dá)到ter時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。由RNA酶切去前導(dǎo)鏈和滯后鏈的引物，引物留下的空隙由DNApolI催化填補(bǔ)，最后，DNA連接酶有ATP功能，將兩個(gè)片段連接成為連續(xù)的子鏈，復(fù)制完成。大腸桿菌的ter含有7個(gè)約23bp共有序列(終止子，terminator)，分別稱(chēng)為terA-terG。此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus(terminusutilizationsubstance)，這個(gè)蛋白質(zhì)可能是通過(guò)阻止解鏈酶(helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制。當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到Ter位點(diǎn)時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻止復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后，在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶W的作用下，使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)(1)復(fù)制起始點(diǎn)及復(fù)制速度：真核生物DNA復(fù)制有許多起始點(diǎn)，原核生物只有一個(gè)；真核生物在完成全部復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上DNA的復(fù)制不能在開(kāi)始，原核生物起始點(diǎn)上可以連續(xù)開(kāi)始新的DNA復(fù)制；真核生物復(fù)制速度是原核生物的1/20,但復(fù)制起始點(diǎn)多，且真核生物中復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開(kāi)始的，即有許多個(gè)復(fù)制子，可以進(jìn)行分段復(fù)制，所以真核生物復(fù)制的總速度可能比原核生物的快DNA聚合酶：真核生物的復(fù)制需要DNA聚合酶及多種蛋白質(zhì)因子的參加，真核生物DNA聚合酶主要有a、B、y、8和￡五種其中pola、pol3在核內(nèi)其主要作用，polY為線粒體復(fù)制酶，pole是一種修復(fù)酶。另外，真核生物的pol3需要與一種稱(chēng)為增殖細(xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)的復(fù)制因子結(jié)合。PCNA相當(dāng)于大腸桿菌polIII的B亞基，能形成一個(gè)環(huán)狀?yuàn)A子，以增加聚合酶的持續(xù)合成能力。在真核生物的復(fù)制中，還有兩個(gè)蛋白質(zhì)因子參與：復(fù)制蛋白A(replicationproteinA,RP-A)是真核生物的單鏈結(jié)合蛋白，相當(dāng)于大腸桿菌的復(fù)制因子C(replicationfactorC,RF-C)是夾子裝置器，相當(dāng)于大腸桿菌的Y復(fù)合物，可促使PCNA安裝到DNA雙鏈上以及拆下來(lái)，還可促使復(fù)制體的裝配。RNA引物和岡崎片段：真核生物復(fù)制中的RNA引物和岡崎片段均小于原核的，引物為10個(gè)核甘酸，和成片段為100~200個(gè)核甘酸；而原核的引物為十幾至幾十個(gè)核昔酸，合成片段1000~2000個(gè)核昔酸(4)端粒(telomere)和端粒酶(telomerase)：端粒是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。端粒結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，一般由多個(gè)短的富含鳥(niǎo)嘌吟(G)的重復(fù)序列串聯(lián)而成，可長(zhǎng)達(dá)10kb以上。人的端粒重復(fù)序列為T(mén)TAGGG,長(zhǎng)達(dá)15kb。主要功能：保證線性DNA的完整復(fù)制；保護(hù)染色體末端不受核酸酶水解和不發(fā)生染色體的異常重組；決定細(xì)胞的壽命。端粒酶是真核生物體內(nèi)存在的一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成。功能：以自身的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄端粒，從而填補(bǔ)DNA復(fù)制中5'末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)的空缺。線粒體DNA的復(fù)制真核生物除了細(xì)胞和染色體外，還有一類(lèi)存在于細(xì)胞之內(nèi)的非基因組DNA,即線粒體DNA(mitochondrialDNA)和葉綠體DNA。二者均為環(huán)狀DNA,其轉(zhuǎn)錄和翻譯的特點(diǎn)與原核細(xì)菌也非常相似。線粒體DNA的復(fù)制機(jī)制是一類(lèi)稱(chēng)為置換型環(huán)狀結(jié)構(gòu)或D-環(huán)(D-loop)復(fù)制的特殊復(fù)制方式，復(fù)制過(guò)程也遵循半保留復(fù)制的原理，由真核DNA聚合酶Y負(fù)責(zé)。RNA種類(lèi)及其特點(diǎn)細(xì)胞RNA通常是線性單鏈分子，但病毒RNA有雙鏈、單鏈、環(huán)狀、線形等多種形式。單鏈RNA分子可自身回折形成局部雙螺旋(二級(jí)結(jié)構(gòu))，進(jìn)一步折疊(三級(jí)結(jié)構(gòu))。除tRNA外，幾乎所有RNA都與蛋白質(zhì)形成核蛋白復(fù)合物(四級(jí)結(jié)構(gòu))。參與蛋白質(zhì)合成的RNA有tRNA、rRNA和mRNA三類(lèi)。此外，RNA還有多種功能，幾乎涉及細(xì)胞功能的所有方面。tRNA的結(jié)構(gòu)及功能tRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，被稱(chēng)為第二遺傳密碼。它不但為每個(gè)三聯(lián)體密碼翻譯成氨基酸提供了接合體，還為準(zhǔn)確無(wú)誤地將所需氨基酸送到核糖體上提供了載體。tRNA的分子質(zhì)量一般在25~30kDa范圍，有73~93個(gè)核昔酸組成，其中含有大量稀有堿基，如假尿嘧啶核昔（2）、二氫尿嘧啶（D）和胸腺嘧啶（T）核昔等。tRNA的三葉草型二級(jí)結(jié)構(gòu)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，都呈三葉草型，具有以下特點(diǎn)：1）氨基酸接受臂：由7對(duì)堿基組成，3'含有CCA-OH序列，接受活化的氨基酸2）T2C環(huán)：由7個(gè)不配對(duì)的堿基組成，環(huán)中含5'GT2C3'序列，可與核糖體表面結(jié)合，通過(guò)5對(duì)堿基組成的T2C臂與tRNA的其余部分相連。3）額外環(huán)或可變環(huán)：堿基種類(lèi)和數(shù)量高度可變，在3~18個(gè)不等，富含稀有堿基。4）反密碼環(huán)：由7個(gè)不配對(duì)的堿基組成，處于中間位的3個(gè)堿基為反密碼子，可識(shí)別mRNA的密碼子，由5對(duì)堿基組成的反密碼臂相連。5）二氫尿嗑咤環(huán)（D環(huán)）：由8~12個(gè)不配對(duì)的堿基組成，具有2個(gè)二氫尿嘧啶。通過(guò)3-4對(duì)堿基組成的二氫尿嘧啶臂（DHU臂）與分子的其余部分相連。tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)一一倒L形tRNA的功能：活化、搬運(yùn)氨基酸到核糖體，參與蛋白質(zhì)的翻譯。tRNA的種類(lèi)及功能.起始tRNA和延伸tRNA：起始tRNA指能特異性地識(shí)別mRNA模板上起始密碼子的tRNA,其他統(tǒng)稱(chēng)為延伸tRNA。原核生物起始tRNA攜帶甲酰甲硫氨酸（fMet）,真核生物起始tRNA攜帶甲硫氨酸（Met）.同工tRNA：由于一種氨基酸可能有多個(gè)密碼子，為了識(shí)別也就有多個(gè)tRNA,即多個(gè)tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)一種氨基酸，這些tRNA就稱(chēng)為同工tRNA。同工tRNA既要有不同的反密碼子以識(shí)別該氨基酸的各種同義密碼，又要有某種結(jié)構(gòu)上的共同性，能被氨基酸-tRNA合成酶識(shí)別。.校正tRNA：分為無(wú)義變和錯(cuò)義突變校正1）無(wú)義突變：在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因中，一個(gè)核甘酸的改變可能使代表某個(gè)氨基酸的密碼子變成終止密碼子（UAG、UGA、UAA）,使蛋白質(zhì)合成提前終止，合成物功能的和無(wú)意義的多肽，這種突變稱(chēng)為無(wú)意義突變（無(wú)義突變）。tRNA可通過(guò)改變反密碼子區(qū)校正無(wú)義突變。2）錯(cuò)義突變：于結(jié)構(gòu)基因中一個(gè)核甘酸的變化，導(dǎo)致一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼，合成無(wú)功能的多肽，叫錯(cuò)義突變。tRNA可通過(guò)反密碼子區(qū)的改變把正確的氨基酸加到肽鏈上，合成正確的蛋白質(zhì)。最常見(jiàn)的tRNA分子有76個(gè)堿基，相對(duì)分子量約2.5X104。不同的tRNA分子可有74?95個(gè)核甘酸不等，tRNA分子長(zhǎng)度的不同主要尤其中的可變環(huán)引起的。tRNA的稀有堿基含量非常豐富，約有70余種。每個(gè)tRNA分子至少含有2個(gè)稀有堿基，最多19個(gè)，多數(shù)分布在非配對(duì)區(qū)，特別是在反密碼子3'端臨近部位出現(xiàn)的頻率最高，且大多為嘌吟核苷酸。這對(duì)于維持反密碼環(huán)的穩(wěn)定性及密碼子、反密碼子之間的配對(duì)是很重要的。rRNA的結(jié)構(gòu)及功能rRNA占細(xì)胞內(nèi)總RNA量的80%,rRNA的功能是組成核蛋白體（核糖體），為蛋白質(zhì)的合成提供場(chǎng)所。原核生物和真核生物核糖體均由易于解聚的大、小亞基組成，每個(gè)亞基分別由幾種rRNA和數(shù)十種蛋白質(zhì)組成。核糖體包括至少5個(gè)活性部位，即mRNA結(jié)合部位、氨基酸-tRNA結(jié)合或接受部位(A位)、肽基-tRNA結(jié)合或接受部位(P位)、形成肽鍵部位(轉(zhuǎn)肽酶)，此外還有負(fù)責(zé)肽鏈延伸的各種延伸因子的結(jié)合位點(diǎn)小亞基上：mRNA結(jié)合位點(diǎn)，負(fù)責(zé)對(duì)序列特異的識(shí)別過(guò)程大亞基上：A位、P位、轉(zhuǎn)肽酶，負(fù)責(zé)氨基酸及tRNA攜帶的功能mRNA的結(jié)構(gòu)及功能mRNA在細(xì)胞內(nèi)只占總RNA的1%?2%，mRNA代謝很快，細(xì)菌mRNA平均半衰期只有2min，真核mRNA半衰期較長(zhǎng)，平均為5h。mRNA的種類(lèi)很多，每一種mRNA的相對(duì)分子量及堿基序列都不同。功能：通過(guò)三聯(lián)體密碼翻譯成蛋白質(zhì)原核和真核生物的mRNA在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別1、生物mRNA與相應(yīng)的基因是共線的，并且是多順?lè)醋?；真核是單順?lè)醋?，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA(核不均一RNA，heterogeneousnuclearRNA)。2、mRNA的5'末端加上一個(gè)m7pGpppNm4g子結(jié)構(gòu)，可使mRNA免遭核酸酶的降解，起到保護(hù)和穩(wěn)定性的作用；可使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合并開(kāi)始合成蛋白質(zhì)；可被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識(shí)別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。3、mRNA的3'末端具有多聚腺甘酸(polyA)尾巴，可能與增加轉(zhuǎn)錄活性及穩(wěn)定mRNA有關(guān)。其他RNA細(xì)胞核RNA(nuclearRNA,nRNA)：核不均一RNA(hnRNA),是真核mRNA的前體。與mRNA之間的主要差別：①nRNA的多核甘酸鏈中的一些片段將不出現(xiàn)于相應(yīng)的mRNA中，這些片段稱(chēng)為內(nèi)含子(intron),而那些保留于mRNA中的片段稱(chēng)為外顯子(exon)。②RNA具有5'端帽子和3'端尾巴的結(jié)構(gòu)和功能小核RNA(smallnuclearRNA,snRNA)核仁小RNA(sonRNA)DNA的損傷與修復(fù)DNA損傷：一切使DNA結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變的DNA變化，如堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)、鏈的斷裂和重組、突變等。維護(hù)DNA遺傳信息的穩(wěn)定性對(duì)生物細(xì)胞來(lái)說(shuō)是極其重要的。生物體對(duì)DNA損傷的修復(fù)系統(tǒng)主要有以下6種：1、聚合酶的“校正”修復(fù)DNA復(fù)制具有非常高的精確度，平均每復(fù)制109個(gè)核甘酸，才出現(xiàn)一個(gè)核甘酸的差錯(cuò)。雖然復(fù)制是以堿基的精確互補(bǔ)配對(duì)為基礎(chǔ)，但堿基配對(duì)有時(shí)仍然會(huì)出錯(cuò)。DNA聚合酶的“校對(duì)”機(jī)制可不斷地糾正復(fù)制過(guò)程中可能出現(xiàn)的差錯(cuò)。DNA聚合酶在復(fù)制DNA時(shí)，首先對(duì)新參與合成的核甘酸要進(jìn)行篩選；其次對(duì)錯(cuò)誤參入的核甘酸則利用其3'5'外切酶活性進(jìn)行切除，使得DNA復(fù)制中出現(xiàn)錯(cuò)配的概率大大減少。另外，DNA聚合酶5'3'合成方向也是確保SNAT復(fù)制準(zhǔn)確的機(jī)制之一。2、光復(fù)活修復(fù)光復(fù)活修復(fù)(PhotoreactivationRepair)作用是一種高度專(zhuān)一的DNA直接修復(fù)①irectRepair)過(guò)程，它只作用于紫外線引起的DNA嘧啶二聚體(主要是TT也有少量CT和CC)。光復(fù)活酶在生物界分布很廣，從低等單細(xì)胞生物一直到鳥(niǎo)類(lèi)都有，而高等的哺乳類(lèi)卻沒(méi)有。A嘧啶二聚體B.合酶結(jié)合于損傷部位C見(jiàn)光激活D.復(fù)后釋放酶3、切除修復(fù)切除修復(fù)(excisionrepair):在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷部分切除，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去部分，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。1)堿基切除修復(fù)(baseexcisionrepair)：小段DNA損傷的修復(fù)。DNA聚合酶、DNA糖甘酶、內(nèi)切酶和連接酶等參與2)核苷酸切除修復(fù)(nucleotide-excisionrepair)：大段DNA損傷的修復(fù)。核酸酶、DNA聚合酶I、DNA聚合酶3或e等參與4、重組修復(fù)光復(fù)活修復(fù)和切除修復(fù)是先修復(fù)，后復(fù)制，又稱(chēng)為復(fù)制前修復(fù)，而重組修復(fù)(recombinationrepairing)是復(fù)制后修復(fù)，是用DNA重組的方法修復(fù)DNA損傷。重組修復(fù)至少需要4種酶組分。重組基因recA編碼一種分子量為40000的蛋白質(zhì)，它具有交換DNA鏈的活力。RecA蛋白被認(rèn)為在DNA重組和重組修復(fù)中均起關(guān)鍵作用。recB、recC基因分別編碼核酸外切酶V的兩個(gè)亞基。此外，修復(fù)合成還需要DNA聚合酶和連接酶。復(fù)制，損傷的DNA仍可復(fù)制，但復(fù)制到損傷部位時(shí)，子鏈就出現(xiàn)了缺口；重組，從完整的母鏈將相應(yīng)的片段移到缺口，而母鏈上形成缺口；填補(bǔ)和連接，母鏈上的缺口由DNA聚合酶進(jìn)行填補(bǔ)合成，最后由DNA連接酶連接。5、錯(cuò)配修復(fù)錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair)是一種特殊的核甘酸切除修復(fù)，用來(lái)切除復(fù)制中新合成DNA鏈上的錯(cuò)配基因。通過(guò)錯(cuò)配堿基的修復(fù)將使復(fù)制的精確性提高102?103倍。復(fù)制錯(cuò)配中的錯(cuò)配堿基存在于新合成的子代鏈中，錯(cuò)配修復(fù)是按模板的遺傳信息來(lái)修復(fù)錯(cuò)配堿基的，因此，該修復(fù)系統(tǒng)必須有一種能在復(fù)制叉通過(guò)之后識(shí)別模板鏈與新合成DNA鏈的機(jī)制，以保證只從新合成的DNA鏈中去除錯(cuò)配堿基。利用腺嘌吟甲基化酶(Dam甲基化酶)和胞嘧啶甲基化酶甲基化腺喋吟和胞喀咤。在復(fù)制完成后的暫短時(shí)間內(nèi)(幾秒或幾分鐘)，只有模板是甲基化的，而新合成的鏈?zhǔn)欠羌谆?。暫時(shí)甲基化的DNA鏈可以作為識(shí)別標(biāo)志，使存在于GATC等序列附近的復(fù)制錯(cuò)配將按親代鏈為模板進(jìn)行那個(gè)修復(fù)。一旦兩條鏈豆被甲基化，錯(cuò)配修復(fù)過(guò)程幾乎不再發(fā)生。錯(cuò)配修復(fù)是一個(gè)非常耗能的修復(fù)過(guò)程，錯(cuò)配的堿基離5'-GATC等序列越遠(yuǎn)，配切除的核昔酸就越多，重新合成新鏈消耗的dNTP就越多。堿基錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)極大，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正。6、SOS修復(fù)SOS修復(fù)(SOSrepair)又稱(chēng)差錯(cuò)傾向修復(fù)(errorpronerepair),是細(xì)胞DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷或DNA復(fù)制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的一系列誘導(dǎo)性修復(fù)。SOS反應(yīng)是由RecA蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。當(dāng)DNA受損傷時(shí)生成足夠量的RecA蛋白，然后RecA蛋白水解LexA蛋白而是許多與修復(fù)有關(guān)的基因激活。SOS反應(yīng)廣泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在極為不利的環(huán)境中求得生存的一種基本功能。原核生物與真核生物復(fù)制的不同.原核生物的復(fù)制是單起點(diǎn)，而真核生物的DNA復(fù)制是多起點(diǎn)的。.原核生物的復(fù)制速度比較快，而真核生物的復(fù)制比較慢。.原核生物的DNA在未完成一條雙鏈的復(fù)制之前可以開(kāi)始下一輪的復(fù)制，但真核生物不可以。4..原核生物和真核生物完成復(fù)制需要的酶不同。5.原核生物完成復(fù)制的區(qū)域在類(lèi)核區(qū)，真核生物的復(fù)制在細(xì)胞核內(nèi)。第三章基因轉(zhuǎn)錄與調(diào)控基因(gene)是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必須的全部核甘酸序列。按照這個(gè)定義，一個(gè)基因不僅包括編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列。一個(gè)細(xì)胞所攜帶的全部遺傳信息或整套基因，稱(chēng)為基因組。原核生物基因組原核生物的基因組比較小，通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成。原核生物的基因組雖然與蛋白結(jié)合，但并不形成染色體結(jié)構(gòu)，只是習(xí)慣上仍將之稱(chēng)為染色體。細(xì)菌染色體DNA在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)致密區(qū)域，即類(lèi)核(nucleoid)，類(lèi)核無(wú)核膜。有些細(xì)菌還含有存在于細(xì)胞質(zhì)中的小型環(huán)狀雙鏈DNA，染色體外的DNA也可能含有遺傳信息，可以進(jìn)行自我復(fù)制，并將遺傳信息傳遞給子代細(xì)胞。操縱子結(jié)構(gòu)是原核基因組的一個(gè)突出的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)操縱子(operon)：是轉(zhuǎn)錄的功能單位，指多個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制，包括結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)節(jié)基因的整個(gè)DNA序列。操縱子結(jié)構(gòu)提供了另一個(gè)簡(jiǎn)潔的方法，保證當(dāng)其中一個(gè)基因被轉(zhuǎn)錄時(shí)，其他具有相關(guān)功能的基因也被轉(zhuǎn)錄。在原核細(xì)胞中，通常是幾種不同的mRNA連在一起，相互之問(wèn)由一段短的不編碼蛋白質(zhì)的間隔序列所隔開(kāi)，這種mRNA叫做多順?lè)醋觤RNA。這樣的一條mRNA鏈含有指導(dǎo)合成幾種蛋白質(zhì)的信息。單順?lè)醋?monocistron)：真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋樱匆环N基因編碼一種多肽鏈或RNA鏈，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件。一個(gè)典型的例子是乳糖操縱子，它由細(xì)菌細(xì)胞中3個(gè)涉及乳糖代謝的基因組成(B半乳糖甘酶、半乳糖背透酶、轉(zhuǎn)乙?；?。操縱子的轉(zhuǎn)錄合成了一個(gè)長(zhǎng)的多順?lè)醋觤RNA分子，其中包含了翻譯3種酶蛋白所需要的編碼信息。真核生物基因組真核生物基因組的規(guī)模遠(yuǎn)大于原核生物基因組，組織復(fù)雜，信息含量高。在整個(gè)DNA序列中蛋白質(zhì)編碼區(qū)域僅占小部分，而非編碼序列則占了很大一部分。1、結(jié)構(gòu)基因大多數(shù)真核生物基因都是由蛋白質(zhì)編碼序列和非蛋白質(zhì)編碼序列兩部分組成的?；蛑械木幋a序列稱(chēng)為外顯子(exon),而基因中的非編碼序列稱(chēng)為內(nèi)含子(intron)。在一個(gè)結(jié)構(gòu)基因中，編碼某一蛋白質(zhì)不同區(qū)域的各個(gè)外顯子并不是連續(xù)地排在一起的，而是經(jīng)常被長(zhǎng)度不同的內(nèi)含子所隔離，形成鑲嵌排列的斷裂方式，所以真核基因有時(shí)被稱(chēng)為斷裂基因。外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成結(jié)構(gòu)基因，在轉(zhuǎn)錄時(shí)一起轉(zhuǎn)錄下來(lái)，內(nèi)含子隨后被切除。外顯子-內(nèi)含子鏈接區(qū)是具有高度保守性和特異性的堿基序列。這一保守序列與剪切機(jī)制密切相關(guān)，它是RNA剪切的信號(hào)序列。幾乎每個(gè)內(nèi)含子5'端起始的兩個(gè)堿基都是GU,3'端最后的兩個(gè)堿基總是AG。由于這個(gè)堿基序列的高度保守性和廣泛性，有人將它稱(chēng)為GU-AG法則。但是，在線粒體基因中不存在這類(lèi)保守序列。2、順式作用元件順式作用元件或稱(chēng)順式調(diào)控元件，是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子、終止子和一些反應(yīng)元件等。一些蛋白質(zhì)因子可通過(guò)結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性。1)啟動(dòng)子(promoter)是指RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列2)增強(qiáng)子(enhancer)是一類(lèi)能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄活性的順式調(diào)控元件，但它本身不具備啟動(dòng)子的活性。增強(qiáng)子一般能使轉(zhuǎn)錄頻率增加10?200倍，具有以下幾個(gè)顯著的特征：①增強(qiáng)子的位置不固定，可以是在某個(gè)基因的5'-端上游，也可以是在3'-端下游，甚至可以在基因的內(nèi)含子內(nèi)。②增強(qiáng)子的序列較長(zhǎng)，可達(dá)數(shù)百個(gè)堿基對(duì)，有時(shí)是重復(fù)序列，其內(nèi)部常含有一個(gè)核心序列“(G)TGGA/TA/TA/T(G)'。③增強(qiáng)子的作用距離比較遠(yuǎn)，可以遠(yuǎn)離它所作用的基因達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。④增強(qiáng)子的作用與其序列的正反方向無(wú)關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。⑤增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，沒(méi)有啟動(dòng)子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。3)沉默子(silencer)是一類(lèi)與特異蛋白因子結(jié)合時(shí)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用的負(fù)調(diào)控元件沉默子：最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細(xì)胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實(shí)這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。沉默子的作用可不受序列方向的影響，也能遠(yuǎn)距離發(fā)揮作用，并可對(duì)異源基因的表達(dá)起作用。3、DNA重復(fù)序列在真核細(xì)胞基因組中，某些序列有相同的拷貝，稱(chēng)為重復(fù)序列。1)單拷貝序列:在整個(gè)基因組中只有一個(gè)或幾個(gè)拷貝的序列稱(chēng)單拷貝序列。約占基因組的60?65%。2)中度重復(fù)序列:中度重復(fù)序列的長(zhǎng)度300?400bp，在基因組中的重復(fù)次數(shù)在102?105之間。如人類(lèi)Alu重復(fù)序列，占人類(lèi)基因組的3?6%,長(zhǎng)300bp,重復(fù)達(dá)30?50萬(wàn)次3)高度重復(fù)序列①衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)重復(fù)序列的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可達(dá)200b②小衛(wèi)星DNA(minisatelliteDNA)重復(fù)序列的長(zhǎng)度從5個(gè)bp③微衛(wèi)星DNA(microsatellitDNA)重復(fù)序列的長(zhǎng)度在2?6bp4、多基因家族多基因家族是真核細(xì)胞基因組中來(lái)源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的一組基因，是由一個(gè)祖先基因經(jīng)重復(fù)和變異形成的，是真核生物基因結(jié)構(gòu)中最顯著的特征之一。如rRNA、免疫球蛋白基因等。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(transcription)是以DNA為模板，以4種NTP為原料，依堿基配對(duì)規(guī)律，由DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下合成RNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄過(guò)程真核生物的一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位就是一個(gè)基因，由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因和相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成。轉(zhuǎn)錄過(guò)程包括：①轉(zhuǎn)錄的起始；②RNA鏈的延伸；③轉(zhuǎn)錄的終止。真核生物RNA聚合酶的三種類(lèi)型，各自催化合成不同的RNA,所催化的轉(zhuǎn)錄起始和終止階段又各有特點(diǎn)，目前對(duì)轉(zhuǎn)錄起始階段了解較多，而對(duì)終止階段卻知之甚少。一、轉(zhuǎn)錄的起始真核生物轉(zhuǎn)錄起始時(shí)，必須有一些蛋白質(zhì)因子參與，稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactors,TF)。三種類(lèi)型的RNA聚合酶分別負(fù)責(zé)三種RNA轉(zhuǎn)錄的起始：RNA聚合酶I的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是rRNA,RNA聚合酶H的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是mRNA前體，RNA聚合酶O的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是tRNA和5sRNA.在一條具有TATA啟動(dòng)子的基因上游，先由TAF和TBP結(jié)合上去，依次結(jié)合上去TFIIA、TFIIB、TFIIF及未磷酸化的CTD的RNApolll,TFIIE、H、J最后結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物上。CTD被TFIIH磷酸化。二、RNA鏈的延伸當(dāng)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成后，在位的RNA聚合酶即開(kāi)始依堿基配對(duì)關(guān)系，按模板鏈的堿基序列，從5,f3’方向逐個(gè)加入核糖核甘酸。三、轉(zhuǎn)錄的終止RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄出rRNA前體3,末端后，繼續(xù)向下游轉(zhuǎn)錄超過(guò)1000個(gè)堿基，此處有一個(gè)18bp的終止序列，在輔助因子的作用下轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶HI轉(zhuǎn)錄模板的下游存在一個(gè)終止子，該終止子是位于GC豐富序列之中的TTTT。RNA聚合酶H有內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄終止功能，能識(shí)別終止子，使轉(zhuǎn)錄終止。RNA聚合酶H轉(zhuǎn)錄出AAUAAA,聚腺甘酸特異因子（CPSF）能識(shí)別它并與之結(jié)合。在CPSF以及切割活化因子（CstF）等因子的作用下，特異的核酸內(nèi)切酶在AAUAAA下游11?30核甘酸處切斷RNA鏈，mRNA前體的轉(zhuǎn)錄即告終止。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄要比原核細(xì)胞復(fù)雜得多，真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄形成的RNA前體分子通常需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的加工修飾過(guò)程才能成為成熟的功能形式。一、mRNA轉(zhuǎn)錄后加工mRNA是三種RNA中唯一具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子，其前體是結(jié)構(gòu)基因在RNA聚合酶H催化下轉(zhuǎn)錄形成的。由于前體分子的大小各不相同，被稱(chēng)為核不均一 RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA）,hnRNA需要經(jīng)過(guò)剪切修飾成為成熟的mRNA,才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。真核生物mRNA的加工過(guò)程主要包括5,端戴帽、3,端加尾、剪接、編輯、化學(xué)修飾等。二、rRNA轉(zhuǎn)錄后加工真核細(xì)胞中rRNA的加工途徑切除5,端的前導(dǎo)序列；從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段。Hela細(xì)胞的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的ITS（內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列）；L細(xì)胞的切點(diǎn)在18S序列和ITS的交界處，稱(chēng)為先成熟。部分退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；最后修正。三、tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾真核生物tRNA前體的加工也頗為復(fù)雜，包括剪接去除內(nèi)含子、剪切5,端先導(dǎo)序列、添加或修復(fù)3,端CCA以及堿基的化學(xué)修飾等。.tRNA前體的剪接.添加或修復(fù)3/端CCA序列.化學(xué)修飾（甲基化反應(yīng)使某些嘌吟生成甲基嘌呤；通過(guò)還原反應(yīng)使某些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶（DHU）；通過(guò)核昔內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng)使尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ず烁剩ㄖ校┑龋┱婧思?xì)胞表達(dá)調(diào)控基因表達(dá)是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。但并非所有基因表達(dá)過(guò)程都產(chǎn)生蛋白質(zhì)（rRNA、tRNA）。整個(gè)基因表達(dá)的過(guò)程分為基因活化、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯、翻譯后加工等。在上述各個(gè)環(huán)節(jié)中均存在著基因表達(dá)調(diào)控的控制點(diǎn)。與原核生物比較，真核生物的基因組更為復(fù)雜，可列舉如下：?真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4X106bp,哺乳類(lèi)基因組在109bp數(shù)量級(jí)，比細(xì)菌大千倍；大腸桿菌約有4000個(gè)基因，人則約有10萬(wàn)個(gè)基因。?真核生物主要的遺傳物質(zhì)與組蛋白等構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在核膜內(nèi)，核外還有遺傳成分（如線粒體DNA等），這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的層次和復(fù)雜性。?原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。?細(xì)菌多數(shù)基因按功能相關(guān)成串排列，組成操縱子的基因表達(dá)調(diào)控的單元，共同開(kāi)啟或關(guān)閉，轉(zhuǎn)錄出多順?lè)醋?01丫&$仃0磔的mRNA；真核生物則是一個(gè)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，即mRNA是單順?lè)醋樱╩onocistron），基本上沒(méi)有操縱子的結(jié)構(gòu)，而真核細(xì)胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構(gòu)成的，這就涉及到多個(gè)基因協(xié)調(diào)表達(dá)的問(wèn)題，真核生物基因協(xié)調(diào)表達(dá)要比原核生物復(fù)雜得多。?原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實(shí)驗(yàn)表明：哺乳類(lèi)基因組中僅約10%的序列為蛋白質(zhì)、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。?原核生物的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子（exon）和內(nèi)含子（intron），轉(zhuǎn)錄后需經(jīng)剪接（splicing）去除內(nèi)含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質(zhì)，這就增加了基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)。?原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個(gè)拷貝外，重復(fù)序列不多。哺乳動(dòng)物基因組中則存在大量重復(fù)序列（repetitivesequences）o真核細(xì)胞表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)（一）真核基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)更多基因表達(dá)是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個(gè)過(guò)程。同原核生物一樣，轉(zhuǎn)錄依然是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核（線粒體基因的轉(zhuǎn)錄在線粒體內(nèi)），翻譯則多在胞漿，兩個(gè)過(guò)程是分開(kāi)的，因此其調(diào)控增加了更多的環(huán)節(jié)和復(fù)雜性，轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控占有了更多的分量。（二）真核基因的轉(zhuǎn)錄與染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化相關(guān)真核基因組DNA絕大部分都在細(xì)胞核內(nèi)與組蛋白等結(jié)合成染色質(zhì)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)中DNA和組蛋白的結(jié)構(gòu)狀態(tài)都影響轉(zhuǎn)錄，至少有以下現(xiàn)象：.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄.組蛋白發(fā)生變化.轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結(jié)構(gòu).轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾?DNA堿基修飾變化（三）真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主真核RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力很低，基本上不依靠自身來(lái)起始轉(zhuǎn)錄，需要依賴(lài)多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調(diào)控中雖然也發(fā)現(xiàn)有負(fù)性調(diào)控元件，但其存在并不普遍；真核基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數(shù)真核基因在沒(méi)有調(diào)控蛋白作用時(shí)是不轉(zhuǎn)錄的，需要表達(dá)時(shí)就要有激活的蛋白質(zhì)來(lái)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。換言之：真核基因表達(dá)以正性調(diào)控為主導(dǎo)。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控調(diào)控作用主要是通過(guò)反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用完成的反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成一、轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成（TATA復(fù)合物）在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成過(guò)程中，RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子是RNA合成起始所必需的因子轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過(guò)程1口尸11結(jié)合TATA^；.RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合TFIID-DNA復(fù)合物；.其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶結(jié)合，轉(zhuǎn)錄起始部位的DNA解鏈，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄二、反式作用因子(稱(chēng)轉(zhuǎn)錄因子)反式作用因子的定義(轉(zhuǎn)錄因子、反式因子)：是一類(lèi)在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中，反式作用因子的作用主要是促進(jìn)或抑制TFIID與TATA盒結(jié)合、RNA聚合酶與TFHD-DNA復(fù)合物結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成分為兩類(lèi)：基本轉(zhuǎn)錄因子：是RNA聚合酶結(jié)合啟動(dòng)子所必需的一組因子，決定三種RNA轉(zhuǎn)錄的類(lèi)別特異轉(zhuǎn)錄因子：為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所必需，決定基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子反式作用因子的主要特點(diǎn)是：①能識(shí)別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中順式作用元件的特異靶序列。②對(duì)基因表達(dá)具有正性調(diào)控和負(fù)性調(diào)控作用，即可激活或阻遏基因的表達(dá)。③他們必須具備識(shí)別與結(jié)合特定DNA序列或與RNA聚合酶、其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合進(jìn)行作用的能力，所以反式作用因子一般有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活域、結(jié)合其它蛋白質(zhì)的結(jié)合域。順式作用元件與反式作用因子的相互作用1.反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合：大部分反式作用因子在激活后與順式作用元件結(jié)合，但也可能有一些反式作用因子是先結(jié)合DNA,被激活后才發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。在不同的基因中，存在著同樣的順式作用元件，增強(qiáng)子和上游啟動(dòng)子元件可以結(jié)合一些相同的蛋白質(zhì)，表明一些數(shù)量有限的基因調(diào)節(jié)蛋白控制著真核細(xì)胞的基因表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)的反式作用因子中常顯示以下幾種DNA結(jié)合域。①a螺旋-轉(zhuǎn)角-a螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-turn-helixmotif)其中一個(gè)為識(shí)別螺旋，含有較多能與DNA相互作用的AA殘基，進(jìn)入DNA雙螺旋的大溝中。②螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域(helix-loop-helixmotif)由3部分組成：兩端為既親水又親脂的兩性a螺旋區(qū)，中間是一個(gè)或幾個(gè)B轉(zhuǎn)角組成的環(huán)區(qū)③鋅指結(jié)構(gòu)域(zincfingermotif)約有30個(gè)AA殘基，其中4個(gè)AA殘基(可以是2個(gè)Cys,2個(gè)His或4個(gè)均是Cys)與Zn2+以配位鍵相互作用，形成s,與DNA雙螺旋大溝結(jié)合。④亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(leucinezippermotif)一段肽鏈中每隔6個(gè)氨基酸即有一個(gè)Leu,該肽段所形成的螺旋就可出現(xiàn)疏水及親水二個(gè)平面，由Leu組成的疏水面即為亮氨酸拉鏈。二個(gè)具亮氨酸拉鏈的反式因子可形成二聚體(同二聚體、異二聚體)。亮氨酸拉鏈不直接與DNA相互作用，拉鏈區(qū)以外結(jié)構(gòu)參與DNA結(jié)合2.反式作用因子的作用方式：反式作用因子在增強(qiáng)子中的結(jié)合位點(diǎn)通常與其所調(diào)控的基因相距較遠(yuǎn)，在上游啟動(dòng)子中的結(jié)合位點(diǎn)也與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)有一定距離。3.反式作用因子的組合式調(diào)控作用：反式作用因子結(jié)合順式作用元件后激活轉(zhuǎn)錄，有時(shí)則抑制轉(zhuǎn)錄。每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可發(fā)揮促進(jìn)或抑制作用，但反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的，而是幾種因子的組合，發(fā)揮特定的作用，稱(chēng)為組合式基因調(diào)控。前體mRNA轉(zhuǎn)錄和加工mRNA前體hnRNA需經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后加工、由胞核運(yùn)至胞漿等過(guò)程，方能作為模板參加蛋白質(zhì)生物合成。對(duì)這一系列過(guò)程的調(diào)節(jié)也可控制某些基因的表達(dá)。一、hnRNA加工成熟的調(diào)節(jié)hnRNA是在核內(nèi)進(jìn)行加工修飾的。加工過(guò)程包括加帽、加尾、剪接、堿基修飾和編輯等。其中剪接和RNA編輯對(duì)某些基因的調(diào)節(jié)有一定的意義。.剪接過(guò)程控制一些蛋白質(zhì)的表達(dá)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄單位有單純型和復(fù)合型。復(fù)合型轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以進(jìn)行不同方式的剪接（選擇性剪接），參加拼接的外顯子可以不按其在基因組的線性分布次序進(jìn)行拼接，內(nèi)含子也可以不被切除而保留，即一個(gè)外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟的mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱(chēng)為選擇性剪接。選擇性剪接常常在一定機(jī)制調(diào)節(jié)下以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式進(jìn)行，即一種mRNA在一種細(xì)胞或組織表達(dá)，而另一種mRNA在另外一種細(xì)胞或組織中表達(dá)。.RNA編輯調(diào)節(jié)某些蛋白質(zhì)的功能RNA編輯的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程是mRNA前體加工過(guò)程中另一可調(diào)節(jié)點(diǎn)。通過(guò)RNA編輯，成熟mRNA的序列已與基因組DNA相應(yīng)外顯子部分有所區(qū)別，指導(dǎo)生成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不再完全由基因中的核甘酸序列決定。RNA編輯在一些較低等真核生物如原生動(dòng)物線粒體、植物及其葉綠體中廣泛存在，而且有些mRNA經(jīng)過(guò)編輯序列改變可達(dá)50%以上。在高等真核生物，RNA編輯非常少見(jiàn)，而且編輯僅涉及單個(gè)核昔酸的改變。二、mRNA運(yùn)輸、胞漿內(nèi)穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)RNA無(wú)論在核內(nèi)進(jìn)行加工、由胞核運(yùn)至胞漿，還是在胞漿內(nèi)停留（至降解）都是與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白體復(fù)合物（RNP）。mRMA的運(yùn)輸、在胞漿中的穩(wěn)定性等均與某些蛋白質(zhì)成分有關(guān)。翻譯水平的調(diào)控翻譯水平的調(diào)控機(jī)制，一般都是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)中特異的mRNA和多種蛋白質(zhì)之間的相互作用實(shí)現(xiàn)的。 蛋白質(zhì)的翻譯不僅與其mRNA編碼序列有關(guān)，并受5'和3'端的非編碼區(qū)（5’UTR和3'UTR）結(jié)構(gòu)的控制一、mRNA的細(xì)胞質(zhì)定位5’非編碼區(qū)從mRNA起點(diǎn)的甲基鳥(niǎo)嘌吟核昔帽延伸到AUG起始密碼子，而3,非編碼區(qū)從編碼區(qū)末端的中止密碼子延伸至多聚A尾巴的末端。控制mRNA在細(xì)胞質(zhì)中定位的信息位于3,非編碼區(qū)，雖然mRNA定位的機(jī)制還不很清楚，但可以認(rèn)為是通過(guò)識(shí)別mRNA中定位序列的蛋白質(zhì)所介導(dǎo)的。微管和微絲與細(xì)胞中特定部位的mRNA的聚集有一定關(guān)系，微管主要涉及轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA到細(xì)胞質(zhì)特定部位，而微絲的作用則被認(rèn)為是用來(lái)錨定已達(dá)到目的地的mRNA。二、mRNA翻譯的調(diào)控蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程很復(fù)雜，涉及眾多成分。目前發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)節(jié)點(diǎn)主要在起始階段和延長(zhǎng)階段，尤其是起始階段。.mRNA5端非編碼區(qū)長(zhǎng)度對(duì)翻譯的影響當(dāng)?shù)谝粋€(gè)AUG密碼子離5,端帽子的位置太近時(shí)，不容易被40S亞基識(shí)別。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)AUG密碼子離5/端帽子結(jié)構(gòu)的距離在12個(gè)核甘酸以?xún)?nèi)時(shí)，有一半以上的核糖體40S亞基會(huì)滑過(guò)第一個(gè)AUG；當(dāng)5/端非編碼區(qū)長(zhǎng)度在17?80個(gè)核甘酸之間時(shí)，體外翻譯效率與其長(zhǎng)度成正比。所以，第一個(gè)AUG至5/端之間的長(zhǎng)度可影響翻譯起始效率和翻譯起始的準(zhǔn)確性。.翻譯起始因子（eIF）活性的調(diào)節(jié)通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)起始因子活性對(duì)起始階段有重要的控制作用。如eIF-2亞基的磷酸化使得鳥(niǎo)甘酸交換因子（GEF,又稱(chēng)eIF-2B）與非活化狀態(tài)的eIF-2-GDP緊密結(jié)合在一起，妨礙了eIF-2的循環(huán)利用，從而影響eIF-2-GTP-Met-tRNAfmet前起始復(fù)合物的形成，抑制了蛋白質(zhì)合成的起始。eIF-4E在mRNA與核蛋白體結(jié)合過(guò)程中至關(guān)重要，決定著起始復(fù)合物能否形成及合成開(kāi)始。它含有帽結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū)，通過(guò)與mRNA5/端帽結(jié)構(gòu)結(jié)合促進(jìn)核蛋白體小亞基結(jié)合于mRNA翻譯起始點(diǎn)部位。三、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)mRNA的半衰期可影響蛋白質(zhì)合成的量，通過(guò)調(diào)節(jié)某些mRNA的穩(wěn)定性，即可使相應(yīng)蛋白質(zhì)合成量受到一定程度的控制。早期實(shí)驗(yàn)證明，缺乏polyA尾的mRNA注射到細(xì)胞內(nèi)后迅速降解，然而，同樣的mRNA因擁有polyA尾而相對(duì)穩(wěn)定，提示mRNA壽命與它的polyA尾長(zhǎng)度有關(guān)。翻譯后水平的調(diào)控從mRNA翻譯合成蛋白質(zhì)，并不意味著基因表達(dá)的調(diào)控就結(jié)束了。新生肽鏈合成后通常還需加工、修飾和正確折疊才能成為有功能的成熟蛋白質(zhì)。其中包括：一、蛋白質(zhì)折疊：二、蛋白酶切割（如胰島素）三、蛋白質(zhì)內(nèi)含子：四、蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾（乙?；?、甲基化、磷酸化等）原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄RNA聚合酶原核生物細(xì)胞中只有1種RNA聚合酶，兼有合成mRNA、tRNA和rRNA的功能。目前研究得比較透徹的是大腸桿菌RNA聚合酶，該酶由多個(gè)亞基組成：a2BB,。稱(chēng)為全酶，去掉。因子的部分a288,稱(chēng)為核心酶。轉(zhuǎn)錄過(guò)程一、轉(zhuǎn)錄的起始首先聚合酶在啟動(dòng)子處識(shí)別并結(jié)合在雙鏈DNA上，隨即通過(guò)解旋DNA的兩條鏈，編碼鏈與模板鏈分開(kāi)，同時(shí)形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionalbubble）,以便讓RNA聚合酶識(shí)別模板，且有利于底物核糖核甘酸的配對(duì)。轉(zhuǎn)錄泡也稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，就^NA聚合酶、DNA模板和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA三者結(jié)合在一體的復(fù)合物（圖3-16）。RNA聚合酶沿DNA鏈前移，RNA鏈也逐漸延長(zhǎng)，DNA雙鏈則隨RNA聚合酶的移動(dòng)不斷小規(guī)模的展開(kāi)，已轉(zhuǎn)錄的區(qū)段又隨即復(fù)合。二、RNA鏈的延伸轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段，原核生物與真核生物之間沒(méi)有太大差別，只是催化的RNA聚合酶不同而已。當(dāng)轉(zhuǎn)錄起始并合成了幾個(gè)核甘酸后，。因子就從起始復(fù)合物上解離下來(lái)，解離的。因子可重新用于轉(zhuǎn)錄起始。隨著。的脫落，核心酶構(gòu)象發(fā)生改變，酶和DNA模板的結(jié)合親和力下降，有利于RNA聚合酶沿模板向前移動(dòng)。三、轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄終止分為三個(gè)步驟，即RNA聚合酶停止移動(dòng)，RNA從RNA聚合酶中的釋放和RNA聚合酶從模板DNA上的釋放等過(guò)程。通過(guò)對(duì)原核生物和噬菌體的基因序列的比較發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄的終止子結(jié)構(gòu)。終止子是基因或操縱子的3,端特定的核甘酸序列，它具有終止轉(zhuǎn)錄的功能。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工由于發(fā)現(xiàn)rRNA和tRNA成熟分子的5'端為單磷酸，而原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為三磷酸；成熟分子比原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物?。怀墒旆肿雍挟惓A基，兒原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中沒(méi)有。因此，rRNA和tRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必然存在一個(gè)加工過(guò)程：、rRNA前體的加工：rRNA前體的剪切，最后得到16SrRNA、23SrRNA及5SrRNA的成熟rRNA二、tRNA前體的加工：.剪切作用tRNA的剪切時(shí)，先由內(nèi)切酶E和F切去3'端側(cè)翼序列。在前體的3'端留下一個(gè)9核甘酸，然后由核酶D依次切去3'區(qū)域的7個(gè)堿基，接著由RNaseP內(nèi)切5'核甘酸，生成成熟的tRNA。最后經(jīng)過(guò)一系列的修飾.添加和修復(fù)3,端CCA序列tRNA3,端CCA序列是tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸時(shí)必不可少的序列。有些tRNA前體中的3,端CCA序列在經(jīng)過(guò)核酸外切酶剪切時(shí)被破壞，也有些tRNA前體加工時(shí)需添加或修復(fù)這一序列。這一作用是由tRNA核酸轉(zhuǎn)移酶催化完成的。.化學(xué)修飾成熟的tRNA分子中有一些稀有堿基，它們是前體中特殊位置的核甘酸在酶作用下經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾形成的。例如tRNA分子中的兩個(gè)假尿嘧啶是由尿嘧啶經(jīng)化學(xué)修飾產(chǎn)生的。原核生物基因表達(dá)調(diào)控原核生物基因表達(dá)調(diào)控的環(huán)節(jié)，主要在轉(zhuǎn)錄水平，其次是翻譯水平。原核轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控最重要的模式一一操縱子操縱子是原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的主要形式，相關(guān)的基因排列成簇，由同一個(gè)啟動(dòng)序列所控制，“一開(kāi)俱開(kāi)，一閉俱閉”，對(duì)環(huán)境條件的改變作出相應(yīng)的反應(yīng)，如乳糖（he）操縱子、阿拉伯糖（ara）操縱子及色氨酸。叩）操縱子等。原核基因的協(xié)調(diào)表達(dá)就是通過(guò)調(diào)控單個(gè)啟動(dòng)基因的活性來(lái)完成的。在很多原核操縱子系統(tǒng)，特異的阻遏蛋白是控制原核啟動(dòng)序列活性的重要因素。當(dāng)阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合或解聚時(shí)，就會(huì)發(fā)生特異基因的阻遏或去阻遏。原核基因調(diào)控普遍涉及特異阻遏蛋白參與的開(kāi)、關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。一、乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)大腸桿菌的乳糖（/ae）操縱子包含了乳糖代謝所需的三個(gè)結(jié)構(gòu)基因Z、Y、A,它們緊密連鎖在一起，形成一個(gè)基因簇，被乳糖一起誘導(dǎo)。這些基因按照Z(yǔ)YA的順序排列，由啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄成多順?lè)醋觤RNA,指導(dǎo)合成大腸桿菌利用乳糖所需的酶類(lèi)。Z基因編碼含1170個(gè)氨基酸的多肽，以四聚體形式組成有活性的B-半乳糖甘酶，催化乳糖的分解；Y基因編碼含260個(gè)氨基酸的半乳糖背透酶，促使環(huán)境中的乳糖進(jìn)入細(xì)菌；A基因編碼含275個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)乙?；?，以二聚體的活性形式催化半乳糖的乙酰化。乳糖操縱子由三個(gè)結(jié)構(gòu)組成：LacZ:編碼B半乳糖甘酶，它可以將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖：LacY:編碼半乳糖背透性酶，它能將乳糖運(yùn)送透過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞壁：LacA:編碼硫代半乳糖甘乙酰轉(zhuǎn)移酶二、CAP的正性調(diào)控CAP的通用名稱(chēng)是分解（代謝）物基因激活蛋白（catabolicgeneactivatorprotein,CAP）在lac操縱子的啟動(dòng)序列上游有一段序列能與CAP特異結(jié)合，稱(chēng)為CAP結(jié)合位點(diǎn)，CAP與這段序列結(jié)合時(shí)，可使轉(zhuǎn)錄提高50倍原則上CAP有兩種方法來(lái)激活轉(zhuǎn)錄：.它可能直接和RNA聚合酶相互作用，增強(qiáng)RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性.或者它作用于DNA,以某種方式改變其構(gòu)象，從而幫助RNA聚合酶結(jié)合增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子有幾種作用方式（1）拓樸效應(yīng)：認(rèn)為增強(qiáng)子的作用是誘導(dǎo)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使核小體產(chǎn)生DNaseI敏感區(qū)，有助于雙螺旋的打開(kāi)，使和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白質(zhì)因子和DNA結(jié)合，然后再延著DNA滑向啟動(dòng)子；(2)滑動(dòng)模型：認(rèn)為增強(qiáng)子通過(guò)一些蛋白質(zhì)因子的介導(dǎo)可與遠(yuǎn)距離的啟動(dòng)子結(jié)合，使DNA形成了一個(gè)環(huán)，從而促使遠(yuǎn)距離的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。這一模型已得到普遍的認(rèn)可。(3)成環(huán)模型：DNA的特殊序列可以和核基質(zhì)結(jié)合形成側(cè)環(huán)，使這些基因能得以表達(dá)，顯示了基因表達(dá)的組織特異性。第四章基因工程基因工程(geneticengineering)是將外源DNA與載體系統(tǒng)連接，通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞使外源DNA克隆和表達(dá)，從而創(chuàng)造生物新品種或新物種的一項(xiàng)遺傳學(xué)技術(shù)。工具酶工具酶：基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等有關(guān)的各種酶系統(tǒng)核酸酶：能將聚核甘酸鏈的磷酸二酯鍵切斷的酶核酸外切酶：能從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核昔的酸核酸核酸內(nèi)切酶：催化水解多核甘酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵的核酸酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上某些特殊堿基序列并且將其切開(kāi)的核酸內(nèi)切酶，也叫限制酶基因工程所用的限制酶都是II類(lèi)限制酶II類(lèi)酶的識(shí)別序列與催化特點(diǎn)特異識(shí)別及切割48個(gè)bp長(zhǎng)度且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生3種缺口：5'—粘性末端、3'—粘性末端、平端或鈍端(平齊末端)回文序列：是指該部位的核甘酸序列呈180O旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)；粘性末端：是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5'—末端突出或3'—末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)性。同裂酶、同尾酶與可變酶其它特殊性質(zhì)的1型限制酶：同裂酶(異源同工酶)、同尾酶、可變酶同裂酶又稱(chēng)異源同工酶。指來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)別序列。在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱(chēng)為同識(shí)同切；切割點(diǎn)也可以是不同的，產(chǎn)生3'或5'粘性末端，稱(chēng)為同識(shí)異切。同尾酶指來(lái)源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類(lèi)酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端。可變酶識(shí)別順序中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別順序往往超過(guò)6個(gè)堿基對(duì)。酶的星號(hào)活性酶的星號(hào)活性：當(dāng)反應(yīng)條件改變時(shí)，第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶的專(zhuān)一性可能會(huì)降低，以致同一種酶可識(shí)別和切割更多的位點(diǎn)pH或離子狀況的改變直接影響酶的活性，因此，為了得到一種限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)速度和理想的消化專(zhuān)一性，必須堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。DNA聚合酶DNA聚合酶IE.ColiDNA聚合酶I(DNApolI)(全酶)是一個(gè)具有3種酶活性的多功能性酶。包括：5'-3'DNA聚合酶活性、5'-3'核酸外切酶活性、3'-5'核酸外切酶活性DNApolI應(yīng)用⑴催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA探針；⑵第二條cDNA鏈的合成；⑶對(duì)DNA3’突出末端進(jìn)行標(biāo)記；⑷DNA序列分析。逆轉(zhuǎn)錄酶特點(diǎn)：逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：⑴以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的RNA⑶以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用：⑴將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,構(gòu)建cDNA文庫(kù)；⑵補(bǔ)平和標(biāo)記5'-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制備雜交探針等。載體與宿主載體(vector)是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA。克隆載體(cloningvector):使目的片段能在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制的載體；表達(dá)載體(ExpressionVector):使目的基因能在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)為RNA或蛋白質(zhì)的載體。載體的種類(lèi)和特性載體必須具備的基本條件①有啟始位點(diǎn)，能自我復(fù)制，或整合到染色體DNA上的能力；②具有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))；③具有合適的遺傳表型或篩選標(biāo)記；④載體的相對(duì)分子質(zhì)量要?。虎菰诩?xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高；⑥必須是安全的。克隆載體用來(lái)克隆和擴(kuò)增DNA片段的載體，具有3點(diǎn)共性：⑴能夠在受體細(xì)胞復(fù)制；⑵帶有藥物抗性基因，便于篩選；⑶可導(dǎo)入受體細(xì)胞。質(zhì)粒載體質(zhì)粒(plasmid)：是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：.分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，有較高的拷貝數(shù).具有1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選.具有多克隆位點(diǎn)總而言之，質(zhì)粒載體應(yīng)該是一種分子量較小、高拷貝的“松弛型”質(zhì)粒，且具有一個(gè)以上遺傳標(biāo)志和多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒。廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：pBR32質(zhì)粒、pUC系列等噬菌體載體噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病毒的總稱(chēng)，其結(jié)構(gòu)要比質(zhì)粒復(fù)雜，在噬菌體DNA分子中，除具有復(fù)制起點(diǎn)外，還有編碼外殼蛋白的基因。噬菌體感染細(xì)菌后，可大量復(fù)制、擴(kuò)增。噬菌體中首先被改造成為載體的是人噬菌體，此外還有單鏈?zhǔn)删w載體和粘性質(zhì)粒載體等。一、入噬菌體載體組成特點(diǎn)：雙鏈線狀DNA分子，全長(zhǎng)50kb,含65個(gè)基因，在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單鏈，是天然的粘性末端，被稱(chēng)為COS位點(diǎn)。入噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長(zhǎng)和溶源性生長(zhǎng)溶菌性生長(zhǎng)（lyticpathway）噬菌體感染細(xì)菌后，借助其2個(gè)COS位點(diǎn)互補(bǔ)成環(huán)，在宿主菌體內(nèi)連續(xù)復(fù)制，合成大量基因產(chǎn)物，進(jìn)而裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌，釋放出來(lái)的噬菌體又可感染其他細(xì)菌。溶源性生長(zhǎng)（lysogenicpathway）噬菌體感染細(xì)菌后，可將自身DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不被裂解。二、M13噬菌體載體6.4kb單鏈閉合環(huán)狀DNA基因組感染宿主細(xì)胞后從感染的細(xì)胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂M13-DNA上的所有基因都是噬菌體增殖所必需的表達(dá)載體基因工程表達(dá)載體是指適宜在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。除了要具備一般載體的特性，如含有選擇標(biāo)記基因、載體的復(fù)制起點(diǎn)、外源基因插入的多克隆位點(diǎn)之外，還需要有能控制外源基因進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄的序列以及適當(dāng)?shù)姆g調(diào)控序列，即具有啟動(dòng)子、翻譯增強(qiáng)子、終止密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、poly（A）信號(hào)和剪接信號(hào)等。原核表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)。對(duì)大腸桿菌表達(dá)載體有如下要求：①有一個(gè)強(qiáng)的啟動(dòng)子，并且轉(zhuǎn)錄是可調(diào)控的；②應(yīng)有SD序列，并且SD序列與起始密碼子ATG之間要有適當(dāng)?shù)木嚯x；③具備適用于外源基因插入的酶切位點(diǎn)，外源基因與載體連接后，必須形成正確的開(kāi)放閱讀框（openreadingframe）；④外源基因下游應(yīng)插入不依賴(lài)p因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（強(qiáng)終止子）。外源基因在大腸桿菌表達(dá)的三種形式非融合型表達(dá)蛋白：直接轉(zhuǎn)錄并翻譯出目的基因開(kāi)放閱讀框架（ORF）對(duì)應(yīng)的多肽序列。易被降解，表達(dá)載體pKK223-3、pPLC245等融合蛋白：將外源基因與受體菌自身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起一同表達(dá)后，在體外應(yīng)用蛋白酶切割或化學(xué)試劑特性性斷裂來(lái)回收外援蛋白。表達(dá)載體pGEX、pMC1871等分泌型表達(dá)蛋白：為了避免被胞內(nèi)蛋白酶降解，表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外或內(nèi)外膜的周間質(zhì)區(qū)中。表達(dá)載體pIN-ompA、pEZZ18等酵母細(xì)胞表達(dá)載體①附加體質(zhì)粒（YEp）YEp主要被用作基因克隆載體。該質(zhì)粒載體含有來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因（Ampr）還有來(lái)自酵母2um質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)以及一個(gè)作為酵母選擇標(biāo)記的URA3基因②自主復(fù)制型質(zhì)粒載體（YRp）YRps常被用作遺傳互補(bǔ)研究，也可用作基因克隆載體。該質(zhì)粒含有來(lái)自細(xì)菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)和作為大腸桿菌選擇標(biāo)記的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）,以及來(lái)自酵母染色體的自主復(fù)制序列（ARS）。③整合型質(zhì)粒載體（YIp）YIp型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低（只有1?10轉(zhuǎn)化子/微克DNA）,但是轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。該質(zhì)粒包含大腸桿菌質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)和作為大腸桿菌選擇標(biāo)記的氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）,以及來(lái)自酵母的遺傳標(biāo)記URA3（尿嘧啶合成途徑中乳清酸核甘5-磷酸脫氫酶基因）、LEU2（亮氨酸合成途徑中B-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶基因）、TRP1和HIS3。動(dòng)物病毒載體真核病毒載體有兩個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn):高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子。目前常用病毒載體有3：SV40病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。轉(zhuǎn)化（transformation）：以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)染（transfection）：以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程；轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）：以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。感受態(tài)細(xì)胞（competentcell）：用特殊方法處理后，受體細(xì)胞才具備接受外源DNA的能力，這種細(xì)胞稱(chēng)感受態(tài)細(xì)胞?；蛑亟M基因重組是遺傳的基本現(xiàn)象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重組現(xiàn)象。減數(shù)分裂或體細(xì)胞有絲分裂均有可能發(fā)生基因重組?；蛑亟M的特點(diǎn)是雙DNA鏈間進(jìn)行物質(zhì)交換。重組體的鑒定一、酶切鑒定從轉(zhuǎn)化菌落中隨機(jī)挑選出少數(shù)菌落，快速提取質(zhì)粒DNA,根據(jù)克隆片段和插入載體位點(diǎn)選擇合適的限制酶酶解，結(jié)果通過(guò)凝膠電泳分析來(lái)確定外源基因是否插入極其插入的方向等。二、籃白篩選它是一種利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑的篩選方法，篩選含有編碼B-半乳糖甘酶的基因。三、PCR鑒定抽提少量重組DNA-PCR擴(kuò)增一電泳鑒定一序列分析四、抗生素篩選法是指利用載體具有抗藥性標(biāo)記的特性直接篩選的方法。帶有抗生素標(biāo)記的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化的則不能生長(zhǎng)。插入失活：當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)物理轉(zhuǎn)化法一、磷酸鈣沉淀法二價(jià)金屬離子能夠促進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞吸收外源DNA,將外源DNA溶解在磷酸緩沖液中，然后加入CaCl2混勻，DNA與磷酸鈣形成顆粒性的共沉淀。這種顆粒性的沉淀物吸附于宿主細(xì)胞表面，通過(guò)胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該法轉(zhuǎn)染效率較低，一般僅為10-4,而且較長(zhǎng)的DNA片段（＞20Kb）效果更差，結(jié)合甘油或DMSO對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行休克的方法，可提高轉(zhuǎn)化效率。二、電轉(zhuǎn)法此法也叫電脈沖刺激法或電擊法。對(duì)于不適于采用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如生長(zhǎng)在懸浮液中的淋巴細(xì)胞，可采用此法進(jìn)行轉(zhuǎn)化：將受體細(xì)胞懸浮于含有待轉(zhuǎn)化DNA的溶液中，在盛有上述懸浮液的電擊池兩端施加短暫的脈沖電場(chǎng)，在外加電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜電位發(fā)生改變，使細(xì)胞膜瞬間產(chǎn)生細(xì)小可逆性的的空洞，增加了其通透性，此時(shí)一定數(shù)量的外源DNA片段便經(jīng)細(xì)胞外擴(kuò)散直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，并進(jìn)一步整合在宿主染色體上，完成轉(zhuǎn)基因過(guò)程三、脂質(zhì)體包埋法用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染四、DNA顯微注射法生物轉(zhuǎn)染法一、動(dòng)物病毒轉(zhuǎn)染法：逆轉(zhuǎn)錄病毒、SV40、腺病毒、牛痘病毒等二、工程胚胎干細(xì)胞法：胚胎干細(xì)胞三、轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植法：哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植第五章PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）：體外酶促合成特異DNA片段的一種方法特點(diǎn)：特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等PCR原理基本反應(yīng)過(guò)程：雙鏈DNA變性（90°C以上進(jìn)行）一引物與單鏈模板的退火（50°C左右進(jìn)行，最使溫度根據(jù)引物順序而定）f引物延伸，合成新的DNA越過(guò)靶區(qū)域（70°C左右進(jìn)行）最終的DNA擴(kuò)增量：Y=（1+X）nY-DNA片斷擴(kuò)增后的拷貝數(shù)X-平均每次的擴(kuò)增效率n-循環(huán)次數(shù)平臺(tái)期（plateau）引物及dNTP底物濃度降低，摻入速度減慢隨產(chǎn)物增加，酶與模板的比例下降，出現(xiàn)底物過(guò)量非特異性產(chǎn)物或引物二聚體與反應(yīng)物的競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)物的再結(jié)合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片斷和短產(chǎn)物片斷兩部分實(shí)現(xiàn)PCR的基本條件PCR體系：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等反應(yīng)條件的優(yōu)化：控制引物濃度、采用合適的耐熱DNA聚合酶、調(diào)整dNTP濃度、Mg2+濃度、緩沖液濃度、控制pH值和設(shè)置合理的循環(huán)參數(shù)等檢驗(yàn)PCR擴(kuò)增效率的三個(gè)指標(biāo)：特異性、有效性、忠實(shí)性模板（DNA或mRNA）DNA可以作為直接作為模板；RNA需要逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后才能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模板的制備很關(guān)鍵模板DNA的用量（每個(gè)反應(yīng)中）：哺乳動(dòng)物基因組DNA—1.0Pg,相當(dāng)于常染色體單拷貝基因的約3X105拷貝數(shù)的DNA量酵母DNA—10ng;細(xì)菌DNA—1ng;質(zhì)粒DNA—1pg引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量