體內(nèi)藥物分析

1體內(nèi)藥物分析2生物樣品分析方法的基本要求常用樣品的種類(lèi)、采集和貯藏生物樣品分析前處理技術(shù)定量分析方法的驗(yàn)證3常用樣品的種類(lèi)、采集和貯藏1、血液（blood）——血漿、血清和全血(1)血樣的采集：注射器直接采集靜脈血（人、兔子）毛細(xì)管眼眶采血、靜脈插管手術(shù)或斷頭取血（大鼠、小鼠）滯留針股靜脈取血（狗）(2)血樣的制備：測(cè)定血中藥物的濃度，通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，尤其是血漿，并非指全血。①血漿(plasma)的制備抗凝劑：肝素（最常用）、EDTA、椐櫞酸鹽、草酸鈣、氟化鈉。4②血清(serum)的制備血漿比血清的分離快，而且制取的量約為全血的50%~60%，血清只為全血的20%~40%，多數(shù)研究者用血漿進(jìn)行分析測(cè)定。③全血（wholeblood）的制備血樣主要用于藥物動(dòng)力學(xué)、生物利用度等研究及臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。52、唾液（saliva）一些藥物的唾液藥濃(S）與血漿游離藥濃（P）密切相關(guān)。因此，TDM中利用對(duì)S的測(cè)定代替對(duì)P的監(jiān)測(cè)——藥代動(dòng)力學(xué)的研究(1)唾樣的采集：在潄口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣(需注意干擾)。(2)唾樣的制備：唾樣采集后，立即測(cè)量其除去泡沫部分的體積，以3000rpm離心10min，取上清液直接測(cè)定或冷凍保存。63、尿液（urine）體內(nèi)藥物清除主要是通過(guò)尿液排出，藥物可以原型、Ⅰ相及Ⅱ相代謝物等多種形式排出。測(cè)定方式——測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)排入尿中的藥物總量樣本采集——時(shí)間尿（在規(guī)定時(shí)間區(qū)間內(nèi)采集），并測(cè)量每次收集的尿液體積。7

生物樣品的貯藏最常用的方法——冷藏或冷凍冷藏或冷凍的時(shí)限：經(jīng)穩(wěn)定性考察后確定冷藏：冰箱(4℃)中——短期保存(1~2d)冷凍：冷柜(-20℃)或低溫冷柜(-80℃)中——長(zhǎng)期保存 1、血樣的貯藏采集后及時(shí)分離血漿和血清（≤2h），分離后置硬質(zhì)玻璃試管中或EP管中完全密塞后再貯存。2、唾液樣品的貯藏測(cè)定唾液pH時(shí)應(yīng)在取樣的當(dāng)時(shí)測(cè)定。為阻止酶催化生成粘蛋白，應(yīng)在4℃以下保存3、尿樣的貯藏采集后應(yīng)立即測(cè)定（≤24h），若不能立即測(cè)定，加入防腐劑后保存，保存時(shí)間為24~36h(4℃)或長(zhǎng)期(-20℃)。8生物樣品分析前處理技術(shù)1、去除蛋白質(zhì)(1)目的：結(jié)合型藥物釋放；減少乳化的產(chǎn)生；保護(hù)儀器去除蛋白質(zhì)的方法；(2)方法：①加入與水混溶的有機(jī)溶劑——蛋白質(zhì)脫水沉淀常用的有機(jī)溶劑——乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氫呋喃等②加入中性鹽——“鹽析”沉淀蛋白質(zhì)常用中性鹽——飽和(NH4)2SO4、Na2SO4、Mg2+、PO43-及枸櫞酸鹽等9③加入強(qiáng)酸——與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子(銨基)形成不溶性鹽沉淀常用的強(qiáng)酸——10%三氯醋酸、6%高氯酸、5%偏磷酸等

④加入重金屬鹽——與蛋白質(zhì)陰離子(羧基)形成鹽沉淀當(dāng)溶液pH高于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子中帶陰電荷的羧基與金屬陽(yáng)離子形成不溶性鹽沉淀。 常用的沉淀劑——CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等10⑤酶水解法——蛋白分解酶分解蛋白質(zhì)加入適量的酶和緩沖液，置水浴上水解一定時(shí)間，過(guò)濾或離心，取上清液供萃取用。⑥超濾法半透膜濾除可溶性生物大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì))；以多孔性半透膜(超濾膜)作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)；⑦加熱法—蛋白質(zhì)變性凝固測(cè)定對(duì)熱穩(wěn)定性好的組分時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白沉淀。112、綴合物的水解(1)酸水解——優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速缺點(diǎn)：專(zhuān)一性較差、藥物分解(2)酶水解——優(yōu)點(diǎn)：專(zhuān)一性較強(qiáng)、藥物無(wú)分解；缺點(diǎn)：時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用大(3)溶劑解綴合物（主要是硫酸酯）往往在萃取過(guò)程中可被加入的溶劑分解，稱(chēng)作溶劑解 目前對(duì)綴合物的分析，逐漸趨向直接測(cè)定綴合物的含量，體內(nèi)以綴合物形式存在的藥物的量，排出體外時(shí)，綴合物占所有排出藥物總量的比率123、分離、純化與濃集(1)目的：①消除內(nèi)源性物質(zhì)、代謝物及其他共存物質(zhì)的干擾；②提取濃縮待測(cè)物質(zhì)，使其易于檢測(cè)(2)方法：①液—液萃取法(傳統(tǒng)的方法)?。阂?液萃取時(shí)應(yīng)考慮選用的有機(jī)溶劑的特性、體積及水相的pH值等因素ⅱ：萃取方法萃取次數(shù)——通常為1次(萃取R在70%以上)，必要時(shí)2~3次(萃取R在50%以下)每次用量——和水相的體積比通常為1:1或2~5:1萃取方式——分液漏斗或渦流混合13ⅲ：水相pH值水相pH值——由藥物的pKa確定——90%以上的非電離形式堿性藥物最佳pH值：高于pKa值1~2個(gè)pH單位酸性藥物最佳pH值：低于pKa值1~2個(gè)pH單位一般規(guī)則：堿性藥物在堿性pH值、酸性藥物在酸性pH值介質(zhì)中提?。簧飿悠芬嗽趬A性或近中性條件下提取——生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)多為酸性，在堿性下不易萃取。ⅳ：其他方法A：離子對(duì)提取法（ion-pairextraction）——種有機(jī)溶劑提取離子性藥物的方法B：提取烷基化法——適用于離子化傾向較大，難以用溶劑直接提取的極性藥物。14②液-固提取法（liquid-solidextraction，LSE）液－固提取法是近十幾年來(lái)在純化生物樣品時(shí)被廣泛采用的方法。也可以認(rèn)為是規(guī)?？s小的柱色譜法。這種方法是應(yīng)用液相色譜法原理處理樣品。將具有吸附、分配及離子交換性質(zhì)的、表面積大的擔(dān)體作為萃取劑填入小柱，以溶劑淋洗后，將生物樣品通過(guò)，使其藥物或雜質(zhì)保留在擔(dān)體上，用適當(dāng)溶劑洗去雜質(zhì)，再用適當(dāng)溶劑將藥物洗脫下來(lái)。與LLE相比較，LSE具有如下優(yōu)點(diǎn)：LSE較少引入雜質(zhì)；消除了LLE的主要缺陷――乳化現(xiàn)象；提取效率高；可用少量生物樣品進(jìn)行分析（如50~100ul的血漿樣品）；柱為可棄型，廢棄物易從實(shí)驗(yàn)室移走；再最后洗脫中多采用以水為主的溶劑系統(tǒng)，大大增加了安全型；最大的優(yōu)點(diǎn)為處理樣品速度快、并在室溫下操作，尤其適用于處理?yè)]發(fā)性及對(duì)熱不穩(wěn)定藥物。15（3）被測(cè)組分的濃集樣品在提取過(guò)程中，雖然被測(cè)組分得到了純化，但因微量的組分分布在較大體積（數(shù)毫升）的提取溶劑中，提取液往往還不能直接進(jìn)行分析。一些分析方法如GC法和HPLC法等都受到進(jìn)樣量的限制，若將提取液直接注入儀器，被測(cè)組分量可能達(dá)不到檢測(cè)靈敏度，因此，常需要使組分濃集后再進(jìn)行測(cè)定。濃集的方法主要有兩種：一種方法是在末次提取時(shí)加入的提取液盡量少，使被測(cè)組分提取到小體積溶劑中，然后直接吸出適量供測(cè)定。另一種方法是揮去溶劑時(shí)應(yīng)避免直接加熱，防止被測(cè)組分破壞或揮失。揮去提取溶劑的常用方法是直接通入氮?dú)饬鞔蹈?；?duì)于易隨氣流揮發(fā)或遇熱不穩(wěn)定的藥物，可采用減壓法揮去溶劑。16

4、化學(xué)衍生化分離前將藥物進(jìn)行化學(xué)衍生化的目的是：（1）使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；（2）提高檢測(cè)靈敏度；（3）增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；（4）提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體分離的能力等。藥物分子中含有活潑Ｈ者均可被化學(xué)衍生化，如含有－COOH、－OH、NH2、、－NH－、－SH等官能團(tuán)的藥物都可被衍生化?；瘜W(xué)衍生化對(duì)GC和HPLC尤為重要。17（一）特異性 內(nèi)源性物質(zhì)不得干擾原藥、代謝物（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

r≥0.9900，至少5個(gè)濃度，不許外延（三）精密度和準(zhǔn)確度

RSD≤15％、20％ 相對(duì)回收率85～115