多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件2014年3月

DNA指紋是從血液或其他組織中提取基因的DNA，用特定方法把DNA切割成很多長(zhǎng)短不等的片段，把這些片段通過電泳的方法按長(zhǎng)短分開，然后轉(zhuǎn)移，固定和雜交.這些雜交的片段可以通過放射自顯影或染色處理顯示出來，形成圖譜，一般包含15-30條帶(即雜交片段)，肉眼可辨.不同個(gè)體的圖譜是不同的，就像人的指紋一樣互不相同.而同一個(gè)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織的DNA指紋是相同的.所以，它既有高度的個(gè)體的特異性，同一個(gè)體又是一致和穩(wěn)定的.從一滴血，一根毛發(fā)，精液，幾個(gè)皮細(xì)胞等小樣品，甚至從鼻中黏膜，唾液，長(zhǎng)久的尸骨都能隨時(shí)做DNA指紋分析.

DNA指紋是從血液或其他組織中提取基因的DNA，用特定方法把DNA切割成很多長(zhǎng)短不等的片段，把這些片段通過電泳的方法按長(zhǎng)短分開，然后轉(zhuǎn)移，固定和雜交.這些雜交的片段可以通過放射自顯影或染色處理顯示出來，形成圖譜，一般包含15-30條帶(即雜交片段)，肉眼可辨.不同個(gè)體的圖譜是不同的，就像人的指紋一樣互不相同.而同一個(gè)體的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段和不同組織的DNA指紋是相同的.所以，它既有高度的個(gè)體的特異性，同一個(gè)體又是一致和穩(wěn)定的.從一滴血，一根毛發(fā)，精液，幾個(gè)皮細(xì)胞等小樣品，甚至從鼻中黏膜，唾液，長(zhǎng)久的尸骨都能隨時(shí)做DNA指紋分析.

DNA指紋技術(shù)在法醫(yī)學(xué)鑒定中的應(yīng)用由犯罪現(xiàn)場(chǎng)殘留的血、精液、唾液、毛發(fā)等成分提取的DNA指紋與嫌疑犯的DNA指紋對(duì)照。誰是兇手？英國(guó)遺傳學(xué)家Jefferys通過DNA分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得了一系列可以在膠片上看到的圖紋，這些圖紋極少有兩個(gè)人完全相同，與人的指紋一樣是每個(gè)人所特有的.故稱為“DNA指紋”1、將毛發(fā)、血痕、精斑、人體組織或白骨等所含的DNA提取出來2、將DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3、選用與探針配對(duì)的限制性核酸內(nèi)切酶，在長(zhǎng)鏈DNA位置上加以切割，將分子量很大的DNA長(zhǎng)鏈切成許多長(zhǎng)度不同的小片段。4、在膠板尺寸較長(zhǎng)的凝膠電泳儀中，對(duì)酶解完全后的DNA片段進(jìn)行電泳，各酶切片段就會(huì)按其長(zhǎng)度大小在電場(chǎng)中進(jìn)行分離。5、先用堿性溶液使凝膠板中分離開的雙鏈DNA片段變性為單鏈片段，然后將凝膠板夾在尼龍膜中，并永久性地固定在尼龍膜上。6、讓放射性DNA探針與尼龍膜上的單鏈DNA片段進(jìn)行雜交。DNA指紋還用于親子鑒定、空難事故受難者殘骸鑒定等。山西省公安廳24小時(shí)出結(jié)果，100%準(zhǔn)確5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段應(yīng)用：

的診斷、

、

、

和DNA

等各方面。遺傳疾病刑偵破案基因克隆序列測(cè)定了解應(yīng)用理解原理放什么物質(zhì)？創(chuàng)設(shè)什么條件？為什么？古生物學(xué)

PCR美國(guó)科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)1988提出的體外以極少數(shù)的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA的方法。1993年獲諾貝爾獎(jiǎng)。解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問題?？焖佟⒏咝А㈧`活、易操作。特點(diǎn)：PlymeraseChainｒｅａｃｔｉｏｎDNA分子的-OH端為3/;磷酸基團(tuán)的末端為5/3’3’5’5’一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）PCR原理1、細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制（1）DNA由兩條反向平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤旋而成的。？?jī)蓚€(gè)脫氧核苷酸通過3-5磷酸二酯鍵連接識(shí)別解旋：形成子鏈:解旋酶催化，氫鍵斷裂以母鏈為模板，在DNA聚合酶的催化下，利用游離的脫氧核苷酸進(jìn)行堿基配對(duì)母鏈子鏈子代DNA1、細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制（2）復(fù)制所需的物質(zhì)及作用：方向？還需什么物質(zhì)？DNA聚合酶特性？作用？引物？（３）子鏈形成不能從頭開始合成子鏈，只能催化從引物的游離3’一OH上連接脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵。按5’→3’的方向延長(zhǎng)。一小段單鏈的DNA或RNA，能與母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)。通常為20—30個(gè)核甘酸方向？引物DNA聚合酶1、細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制（小結(jié)）模板

親代DNA解開雙鏈解旋酶子鏈形成DNA聚合酶引物原料四種脫氧核苷酸能量ATP過程及需要的物質(zhì)？高溫為什么能使DNA解旋？耐高溫的DNA聚合酶如何篩選？引物結(jié)合、DNA聚合酶最適溫度是多少?體外合成DNA？需擴(kuò)增的DNA高溫90—95℃DNA聚合酶（耐高溫）人工合成引物

四種脫氧核苷酸ATPDNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100℃

）復(fù)性（緩慢冷卻）2、DNA復(fù)制的人工控制（1）DNA的熱變性——控制溫度控制解旋與結(jié)合

（2）耐高溫的TaqDNA聚合酶從水生耐熱細(xì)菌中篩選。提高了效率，PCR趨于自動(dòng)化.DNA聚合酶最適溫度是70—75℃高溫為什么能使DNA解旋？引物結(jié)合、DNA聚合酶最適溫度?耐高溫的DNA聚合酶如何篩選？(利于引物與母鏈結(jié)合，55℃最好)94℃最好)3.PCR需要的物質(zhì)及條件6）自動(dòng)調(diào)控控制溫度的儀器，使DNA變性（90—95℃）復(fù)性（55℃）延伸72℃。1）需擴(kuò)增的模板DNA2）耐高溫的DNA聚合酶3）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物4）原料（四種脫氧核苷酸）5）一定的緩沖液

放什么物質(zhì)？什么條件？為什么？什么是PCR的三步曲？（1）PCR循環(huán)--變性94℃變性（二）PCR三步曲條件及結(jié)果？（1）PCR循環(huán)--變性（1）PCR循環(huán)--變性94℃變性（2）PCR循環(huán)—復(fù)性（退火）55℃復(fù)性（3）PCR循環(huán)—延伸（3）PCR循環(huán)—延伸PCR預(yù)變性變性94℃30s延伸72℃1min退火55℃30s94℃5min控制溫度變化的溫控設(shè)備1）需擴(kuò)增的模板DNA2）耐高溫的DNA聚合酶3）與兩條模板鏈互補(bǔ)的引物4）原料（四種脫氧核苷酸）5）一定的緩沖液復(fù)制n次，要放多少原料和引物？引物特點(diǎn)？形成多少產(chǎn)物？產(chǎn)物完全相同嗎？疑問第一次解旋高溫的時(shí)間長(zhǎng)？模板鏈會(huì)結(jié)合嗎？MULLIS教授是個(gè)興趣廣泛，愛好戶外活動(dòng)、性格特殊的人，一次外出的返家途中，他駕駛著汽車在一條彎曲的山路上，在汽車開始駛?cè)肫教构P直的公路時(shí)，他突然聯(lián)想：已經(jīng)經(jīng)過的山路好像是折疊纏繞的DNA雙螺旋，被熱變性成兩條解開的5‘→3’的單鏈就是山腳下平坦筆直的上車道，它們可以是DNA合成的模板，如果正在行駛的小汽車代表了一小段DNA引物，加入的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸.正是他開汽車時(shí)的聯(lián)想，使他以后發(fā)明了PCR..(1)在合適位置寫出在復(fù)性步驟中另種引物。

HO—A—G—5′(2)某同學(xué)設(shè)計(jì)的兩組引物都不合理，請(qǐng)分別說明理由。②引物I’自身折疊后會(huì)出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效①引物I和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效(三）難點(diǎn)解析1、引物引物之間及引物內(nèi)部堿基勿互補(bǔ)特點(diǎn)？種類？書寫？2種

①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為

。②在第

輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。(三）難點(diǎn)解析1、引物2n2nX2—2DNA的數(shù)量=需要引物的數(shù)量=15/163數(shù)量？產(chǎn)物鏈的長(zhǎng)短？第幾次循環(huán)有短產(chǎn)物鏈？第幾次出現(xiàn)兩條均為短產(chǎn)物？?jī)蓷l均為短產(chǎn)物的數(shù)量公式？2；3；2n—2nPCR：在TaqDNA聚合酶的作用下，只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列；子代DNA單鏈中只有兩條無引物，其余均含引物。處于兩引物之間的DNA序列呈指數(shù)增長(zhǎng)。2、產(chǎn)物鏈的長(zhǎng)短。達(dá)標(biāo)測(cè)評(píng)1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)CDNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案‘D診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？從子鏈的5’端向3’端延伸“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。經(jīng)4輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，如圖2所示，其中第⑤種DNA分子有幾個(gè)：A、2B、4C、6D、8（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（要更換槍頭）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好P