蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法目錄1經(jīng)典方法2新的方法3測(cè)定方法的選擇前言難點(diǎn)背景蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容是臨床診斷疾病及檢查健康情況的重要指標(biāo)也是很多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)意義這些分析方法需要一個(gè)合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或者其組成氨基酸的序列信息以便準(zhǔn)確估計(jì)目的蛋白濃度在蛋白質(zhì)分離純化過程中，測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度是一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，可以幫助人們計(jì)算產(chǎn)率、進(jìn)行物質(zhì)平衡或測(cè)定靶蛋白的特定活力/效力。缺少這一技術(shù)的輔助，我么就無法明確得知某種蛋白質(zhì)的存在，也就無法完成分離提純的最終目的。1經(jīng)典方法1.1凱式定氮法[原理]絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的氮元素含量相當(dāng)接近，一般恒定在15～17%，平均值為16%左右。只要測(cè)定出生物樣品中的含氮量，再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)換算系數(shù)（均值為6.25、乳制品為6.38），就可以計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。CuSO4作催化劑；K2SO4提高溶液的沸點(diǎn)消化好的樣品在凱氏定氮儀內(nèi)經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行滴定，記錄，計(jì)算出樣品含氮量高溫條件下強(qiáng)酸(濃H2SO4)把樣品中的蛋白質(zhì)的有機(jī)氮全部消化為無機(jī)氮形式1.1凱氏定氮法——結(jié)果計(jì)算只含蛋白質(zhì)若測(cè)定的樣品含氮部分只是蛋白質(zhì)：樣品中蛋白質(zhì)含量（%）=總氮量×6.25若樣品中尚含有其他含氮物質(zhì)，則需加入三氯乙酸，然后測(cè)定未加三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸后樣品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及總氮量，從而計(jì)算出蛋白氮，再進(jìn)一步算出蛋白質(zhì)含量：蛋白氮=總氮-非蛋白氮蛋白質(zhì)含量（%）=蛋白氮×6.25含氮雜質(zhì)1.1凱氏定氮法——三鹿奶粉事件化學(xué)式：C3N6H6分子量：126含氮量：66.6%鮮牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0.1克三聚氰胺，理論上就能提高0.625%蛋白質(zhì)三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，但是尿素等卻有氣味，參入會(huì)容易被檢測(cè)出來牛奶和奶粉添加三聚氰胺，就是因?yàn)樗苊俺涞鞍踪|(zhì)三聚氰胺1.2雙縮脲法(Biuret法)[原理]雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物雙縮脲凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。1.2雙縮脲法——操作步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)溶液A540對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。測(cè)定范圍為1~10mg蛋白質(zhì)。試劑(ml)\管號(hào)空白管12345測(cè)定管蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（10g/L）-0.10.20.30.40.5-生理鹽水0.50.40.30.20.1-0.4待測(cè)樣品------0.1雙縮脲試劑3.03.03.03.03.03.03.0相當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)（g/L）01020304050

1.3紫外吸收法[原理]蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。1.3四種紫外吸收法

280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm處具有最大吸收，且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定待測(cè)溶液A280對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度

280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260≈1.8純核酸的光吸收比值：A280/A260≈0.5對(duì)于含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260

215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。肽鍵測(cè)定法蛋白質(zhì)溶液在238nm處的光吸收的強(qiáng)弱，與肽鍵的多少成正比。進(jìn)行蛋白質(zhì)溶液的柱層析分離時(shí)，洗脫液也可以用238nm檢測(cè)蛋白質(zhì)的峰位。1.4Folin-酚試劑法[原理]又叫Lowry法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。這種方法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin-酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。Pr.+Cu2+Cu-ProteinBlueProductOH-磷鉬酸磷鎢酸在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）1.4Folin-酚試劑法——操作步驟試劑（ml）\管號(hào)O12345測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（250μg/ml）—0.20.40.60.81.0—待測(cè)溶液——————1.00.9%NaCl1.00.80.60.40.2——堿性銅試劑5.05.05.05.05.05.05.0混勻，室溫放置20min酚試劑0.50.50.50.50.50.50.5721分光光度計(jì)，波長(zhǎng)750nm，記錄吸光度值進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線四種經(jīng)典方法的比較方法靈敏度時(shí)間原理干擾物質(zhì)說明凱氏定氮法靈敏度低，適用于0.2-1.0mg氮，誤差為±2%費(fèi)時(shí)。8-10h將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定。非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離。用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少，費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。雙縮脲法靈敏度低，1-20mg。中速。20-30min多肽鍵＋堿性Cu2+→紫色絡(luò)合物。硫酸銨：Tris緩沖液；某些氨基酸。用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似。紫外吸收法較為靈敏，50-100mg?？焖?。5-10min蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收。各種嘌呤和嘧啶；各種核苷酸。用于層析柱流出液的檢測(cè)；核酸的吸收可以校正。Folin-酚試劑法靈敏度高，~5mg。中速。40-60min堿性下肽鍵與Cu2+生成復(fù)合物，還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑生成藍(lán)色化合物，在750nm處光吸收峰。酚類，硫酸銨，Tris緩沖液，甘氨酸，甘油，糖類，檸檬酸。應(yīng)用最廣泛，耗時(shí)較長(zhǎng)，需精準(zhǔn)把握時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格直線形式，干擾物質(zhì)較多，專一性差。2新的方法2.1考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[原理]考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。2.1考馬斯亮藍(lán)法2.2BCA比色法[原理]堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑（4，4’-二羧酸-2，2’-二喹啉鈉）形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。2.2BCA比色法——操作步驟這種方法的突出優(yōu)點(diǎn)是：1.準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-2000μg/ml；MicroBCA試劑測(cè)定范圍是0.5-20μg/ml。2.快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便。3.經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測(cè)定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。4.檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán)?；旌螧CA工作試劑（試劑A：試劑B=50：1）充分混合（0.1mL樣品+工作試劑）溫育：37℃,30min.然后冷卻分光光度計(jì)562nm讀吸光度2.3熒光淬滅法[原理]采用熒光法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，當(dāng)溶液中含有表面活性劑時(shí)，熒光染料分子之間通過疏水相互作用形成二聚體或多聚體，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，加入蛋白質(zhì)溶液導(dǎo)致多聚體解聚而使熒光強(qiáng)度增加，隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。熒光淬滅原因：這可能是由于表面活性劑存在下蛋白質(zhì)聚集成超分子結(jié)構(gòu)時(shí)包裹了FITC導(dǎo)致FITC熒光被淬滅,從而表現(xiàn)出隨著蛋白質(zhì)溶液濃度增加而出現(xiàn)熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象。2.3熒光淬滅法——操作步驟在酶標(biāo)板每孔中加入50μL稀釋后的FITC(異硫氰基熒光素)緩沖溶液，再分別加入50μL濃度為10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)溶液，混合均勻后靜置5min再進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度水平平行分析3次取平均值。儀器參數(shù)設(shè)定如下:振蕩30s，激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm，每孔取25次讀數(shù)的平均值，積分時(shí)間20μs，測(cè)定溫度37.0℃。3測(cè)定方法的選擇第一章

吉滿杯的簡(jiǎn)單介紹可檢測(cè)范圍內(nèi)的樣品體積可達(dá)到最好的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍，尤其是對(duì)于熒光分析法。膜蛋白或容易聚合的蛋白質(zhì)經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生溶解問題，使得最后測(cè)定達(dá)不到預(yù)期的結(jié)果。共價(jià)修飾蛋白，比如糖基化和PEG化的蛋白會(huì)干擾某些方法的測(cè)定。如果要同時(shí)測(cè)定多個(gè)樣品，選擇微孔板分析可以一次性完成，更加高效。如果樣品量是很有限，選擇非破壞性的方法，比如紫外吸收法可能更合適。開始：蛋白樣品蛋白溶液不含有干擾性物質(zhì)所有方法均可選擇BSA、IgG做標(biāo)準(zhǔn)蛋白，避免使用Bradford法、aminederivatization法避免使用Bradford法、Lowry法避免UVAbs280nm、Bradford法硫醇或還原性試劑存在e.g.DTT避免BCA法、Lowry法螯合劑存在，e.g.EDTA避免BCA法、Lowry法洗滌劑存在，e.g.用于蛋白溶解檢查洗滌劑兼容性數(shù)據(jù)用于沉淀的高濃度鹽、酸存在檢查BCA、LowryBradford兼容性數(shù)據(jù)溶液中有胺或銨離子避免BCA、Lowry、aminederivatization法有合適的參考標(biāo)準(zhǔn)蛋白游離蛋白而非翻譯后修飾蛋白（糖基化）蛋白MW>8kDa含有多個(gè)Tyr/Trp否否否否是是是是是是是是是干擾性物質(zhì)的兼容濃度Conclusion2ndpriorityinitiatives12345EvaluatewhetherofferDTstoremoremarginispossibleTogetherwithotherstrongbrands,communicate“