GB/T 18648-2002非洲豬瘟診斷技術(shù)

ICS.11.220B41中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18648—2002非洲豬癌診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforrAfricanswinefever2002-02-19發(fā)布2002-05-01實施中華人民共和國發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)非洲豬診斷技術(shù)GB/T18648-2002中中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版發(fā)行北京西城區(qū)復(fù)興門外三里河北街16號郵政編碼：100045電話：63787337、637874472002年7月第一版2004年11月電子版制作書號：155066·1-18544版權(quán)專有侵權(quán)必究舉報電話：（010)68533533

GB/T18648-2002非洲豬癌(Africanswinefever,簡稱SF)是由非洲豬癌病毒（ASFV)引起的豬的一種急性、熱性高度接觸傳染性疾病。其特征為病程短·病死率高·臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬癌，表現(xiàn)高熱皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血。為世界動物衛(wèi)生組織WorldOrganizationforAnimalHealth(英)OfficeIntentionaldesEpizootic(法）,OIE和我國規(guī)定的動物一類疾病。病毒在鮮肉和腌肉中能存活數(shù)ASF的實驗室診斷分為兩類：第一類包括病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的檢測;第二類包括抗體的檢測。試驗方法的選擇主要依據(jù)本國或本地區(qū)的疾病情況而定。在沒有ASF但又懷疑該病存在的國家，實驗室診斷必須應(yīng)用無感染性的診斷方法，即應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)檢測病毒基因組DNA和應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清抗體。我國是無ASF國家，目前尚無ASF的檢疫方法。農(nóng)業(yè)部動物檢疫所于1997年與美國梅島動物病研究中心進行了ASF的無感染性快速檢測方法的合作研究，建立了適合于我國使用的由可疑感染動物血液和內(nèi)臟器官中直接檢測ASFVDNA的PCR技術(shù).以及檢測血清中ASFV抗體的ELISA方法。本標(biāo)準(zhǔn)對這兩種方法技術(shù)要求作了規(guī)定。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B和附錄C都是標(biāo)準(zhǔn)的附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：農(nóng)業(yè)部動物檢疫所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：蔣正軍、王樹雙、尹燕博、蔡麗娟、郭福生、陸明哲、孫淑芳、龔振華

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18648-2002非洲豬癌診斷技術(shù)DiagnostictechniquesforAfricanswinefever1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬癌(ASF)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的技術(shù)要求本標(biāo)準(zhǔn)適用于生豬和野豬等易感動物及其產(chǎn)品ASF的診斷和檢疫，2PCR試驗2.1材料準(zhǔn)備2.1.1樣品DNA制備方法見附錄A(標(biāo)準(zhǔn)的附錄)2.1.2電泳液緩沖液的配制方法見附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）2.1.3標(biāo)準(zhǔn)ASFV-BA株DNA、引物1、引物2、1.25mmol/LdNTP和載樣緩沖液2.1.4臺克(Taq)DNA聚合酶、分子量為100堿基對(bp)Ladder(標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker)0和10倍濃度的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增緩沖液。2.1.5自動DNA熱循環(huán)儀2.2操作方法2.2.1將下列試劑按要求量加入到0.75mL的離心管中：滅菌蒸留水(24.5PL.);10倍濃度的PCR擴增緩沖液(5PL)：1.25mmol/LdNTP存液(8PL)；引物1(1L);引物2（1PL)；樣品DNA溶液(10L)見附錄A)：TaqDNA聚合酶(0.5L)。2.2.2設(shè)定兩個對照，陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)的ASFV-BA株的10LDNA含量為10{g:陰性對照為不含DNA的滅菌蒸留水10/L。2.2.3取50″L礦物油覆蓋在混合液上。2.2.4將加有樣品或?qū)φ栈旌衔锏腅ppendorf管放入自動DNA熱環(huán)儀中按下述程序和條件進行DNA擴增：94C5min.50C2min.72C3min循環(huán)一次94C1min.50C2min.72C3min循環(huán)30次94C1min.50C2min,72C10min循環(huán)一次,最后置于4C保存2.2.5上述步驃完成后，從礦物油下小心取出每種反應(yīng)混合物20“L·放入另一支干凈的Eppendorf管中并加2載樣緩沖液，2.2.6將所有樣品按編號加入到對應(yīng)2%瓊脂凝膠（見附錄B1)板的各孔中.其中一孔加標(biāo)準(zhǔn)陽性DNA樣品，在凝膠的邊孔中加入標(biāo)準(zhǔn)分子量DNAMarker。2.2.7將凝膠在150V恒定電壓下電泳2h。2.2.8結(jié)果判定：用紫外光源檢查凝膠。如為陽性樣品則出現(xiàn)一條孤立的、與陽性對照PCR產(chǎn)物的同步遷