GB/T 18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)

ICS11.220B41中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18936—2003高致病性禽流感診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforhighlypathogenicavianinfiuenza2003-01-10發(fā)布2003-05-01實(shí)施華中和八發(fā)布國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

GB/T18936—2003前高致病性禽流感（highlypathogenicavianinfluenza,簡(jiǎn)稱HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬中的A型流感病毒引起的，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織WorldOrganizationforAnimalHealth（英）.OfficeInternationaldesEpizooties（法）,OIEJ列為A類疾病,我國將其列為一類動(dòng)物疫病。本標(biāo)準(zhǔn)是參考（IE《診斷試驗(yàn)和疫苗標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)》2000年版).并結(jié)合我國現(xiàn)有動(dòng)物衛(wèi)生法規(guī)及農(nóng)業(yè)部對(duì)禽流感的相關(guān)政策和措施制定的。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄B、附錄（、附錄D、附錄E、附錄F為規(guī)范性附錄，附錄A為資料性附錄本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所本標(biāo)準(zhǔn)起草人：唐秀英、李海燕、田國斌。

GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了高致病性禽流感(HPAI)病毒分離與鑒定技術(shù)、血凝(HA)和血凝抑制（HI)試驗(yàn)、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散（AGID)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的高致病性禽流感病毒分離與鑒定技術(shù)適用于各種禽類高致病性禽流感的病原分離和鑒定：AGID和間接ELISA適用于A型禽流感病毒的型特異性檢驗(yàn)：HA-HI試驗(yàn)適用于禽流感病毒的血凝素亞型鑒定2病毒分離和鑒定技術(shù)21材料準(zhǔn)備2.1.1病料的采集：死禽采集氣管、牌、肺、肝、腎和腦等組織樣品·進(jìn)行分別處理或者同時(shí)處理;活禽病料應(yīng)包括氣管或泄殖腔執(zhí)子.尤其是以采集氣管執(zhí)子更好;小珍禽用執(zhí)子取樣易造成損傷，可采集新鮮類便。2.1.2病料的保存：病料應(yīng)放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS)內(nèi)(無PBS可用25%～50%的甘油鹽水)。抗生素的選擇視當(dāng)?shù)厍闆r而定，組織和氣管拔子懸液中應(yīng)含有青霉素(2000IU/mL.)、鏈霉素(2mg/mL）、慶大霉素(50g/mL)和制霉菌素(1000IU/mL.)，但糞便和泄殖腔執(zhí)子所有的抗生素濃度應(yīng)提高5倍.加人抗生素后pH值應(yīng)調(diào)至7.0～7.4。在室溫放置1h～2h后樣品應(yīng)盡快處理,沒有條件的可在4℃存放幾天,也可于低溫條件下保存（—70℃購存最好)。2.1.3病料的處理：將棉斌子充分搶動(dòng)、檸干后棄去技子;糞便、研碎的組織用含抗生素的pH值7.0～7.4的等滲PBS溶液配成10%～20%（g/mL)的懸液。樣品液經(jīng)1000r/min離心10min.取上清液作為接種材料。2.2病毒分離2.2.1樣品接種：取處理好的樣品,以0.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡～11日齡SPF雞胚·每個(gè)樣品接種5個(gè)胚，于35C～37℃孵化箱內(nèi)孵育.18h后每8h觀察雞胚死亡情況。2.2.2病毒收獲：無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液,測(cè)血凝活性,陽性反應(yīng)說明可能有正黏病毒科的流感病毒;若無血凝活性或血凝價(jià)很低，則用尿囊液繼續(xù)傳2代，若仍陰性.則認(rèn)為病毒分離陰性。2.3病毒鑒定2.3.1A型流感病毒的型特異性鑒定：樣品接種雞胚后，若雞胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性雞胚的絨毛尿囊膜(CAM)制成抗原,與A型禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行AGID試驗(yàn),檢測(cè)樣品中是否含有A型流感病毒。2.3.1.1抗原制備：從縣有血凝活性的雞豚中取出絨手尿囊膜,用pH7.2的PBS沖洗后.將CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反復(fù)凍融3次～4次;以1000r/min離心10min后取上清,按終濃度為0.1%的量加入甲醛溶液。置37C溫箱滅活36h做滅活檢驗(yàn)后即可作為AGID試驗(yàn)用抗原,用禽流感標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行型特異性鑒定，若被檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清之間出現(xiàn)清晰的沉淀線即可判定樣品中含有A型禽流感病毒2.3.1.2AGID試驗(yàn)方法：按本標(biāo)準(zhǔn)第4章中的方法進(jìn)行