第二章蛋白質化學3-蛋白質結構與功能的關系2

2023/2/2生物化學Biochemistry第二章蛋白質protein第五節(jié)

蛋白質結構與功能的關系（TheRelationofStructureandFunctionofProtein）（一）一級結構是空間構象的基礎

一、蛋白質一級結構與功能的關系

牛胰核糖核酸酶的一級結構二硫鍵

天然狀態(tài)，有催化活性

尿素、β-巰基乙醇

去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性多肽鏈中氨基酸的排列順序決定了肽鏈的折疊和卷曲方式部分氨基酸殘基在蛋白質空間結構中處于關鍵位置

1、種屬差異同源蛋白（homologousprotein)

在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質。同源蛋白質的氨基酸順序具有明顯的相似性即為序列同源。

（二）一級結構與功能的關系如不同哺乳動物的胰島素分子結構都由A和B兩條鏈組成，且二硫鍵的配對和空間構象極其相似。一級結構也相似，僅有個別氨基酸有差異，因此它們都執(zhí)行著相同的調節(jié)糖代謝的生理功能。同源蛋白的一級結構中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基（invariantresidue）

。其他位置的氨基酸差異較大，稱為可變殘基（variableresidue）

。哺乳動物胰島素氨基酸序列差異胰島素人豬狗兔牛羊馬

氨基酸殘基序列號A5ThrThrThrThrAlaAlaThrA6SerSerSerGlyGlySerSerA10IleIleIleIleValValIleB30ThrAlaAlaSerAlaAlaAla

是一種與血紅素輔基共價結合的單鏈蛋白，存在于真核生物線粒體中。相對分子量約為13,000，含有104個氨基酸殘基。近100個種屬的細胞色素c氨基酸順序已被測定。肽鏈中28個位置的氨基酸對所有已測試的種屬都相同的，表明，這些殘基是規(guī)定細胞色素c功能所必需的。細胞色素c（cytochromec,Cyt.c）生物名稱與人不同的氨基酸參加數目生物名稱與人不同的氨基酸參加數目黑猩猩0響尾蛇14恒河猴1海龜15兔9金槍魚21袋鼠10角鮫23牛、豬、羊10小蠅25狗11蛾31驢11小麥35馬12粗糙鏈孢菌43雞、火雞13酵母菌44不同生物與人細胞色素c的氨基酸數目比較

狗人猴

馬騾

鯨兔豬袋鼠企鵝雞鴨響尾蛇龜蒼蠅蛾脈孢菌屬念珠菌屬面包酵母菌小麥牛蛙金槍魚動物爬行動物兩棲動物魚哺乳動物鳥昆蟲植物脊椎動物從細胞色素C的一級結構看生物進化生物進化2、一級結構改變引起分子病

例：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)基因突變導致蛋白質一級結構的突變，導致蛋白質生物功能的下降或喪失，這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病（moleculardisease）”。

最早從分子水平證明的先天性遺傳病——鐮刀形紅細胞貧血癥(sickle-cellanemia)。鐮刀形紅細胞正常血細胞hemoglobin6:GAA(Glu) ->GTA(Val)血紅蛋白-鏈上谷氨酸變成纈氨酸鐮刀狀貧血病的分子機理3、蛋白質前體的激活

一些蛋白質或酶在細胞中首先合成的是其前體,在成為有功能的蛋白質或酶之前需要激活.

例如,胰島素(insulin).的前體是胰島素原(proinsulin),要在切除C肽之后才轉變?yōu)榛钚缘囊葝u素胰島素原的一級結構一級結構差異越小，功能相關性越大。一級結構上的細微變化可直接影響其功能（一）血紅蛋白與肌紅蛋白的結構

二、蛋白質空間結構與功能的關系

1、血紅素

肌紅蛋白(myoglobin,Mb)與血紅蛋白都是含有血紅素輔基的蛋白質。血紅素是鐵卟啉化合物，由4個甲炔基相連成為一個環(huán)形，Fe2+居于環(huán)中。鐵離子有6個配位鍵，其中4個與吡咯環(huán)的N配位結合，1個配位鍵和肌紅蛋白的93位組氨酸殘基結合，氧則與Fe2+

形成第6個配位鍵，接近第64位（E7)組氨酸。肌紅蛋白（myoglobin,Mb）

肌紅蛋白是一個只有三級結構的蛋白質，有8段α-螺旋結構，分別成為ABCDEFGH肽段。整條多肽鏈折疊成緊密球狀分子，氨基酸殘基上的疏水側鏈大都在分子內部，富極性及電荷的則在分子表面，因此水溶性較好。Mb分子內部有個袋形空穴，血紅素居于其中。血紅蛋白（hemoglobin,Hb）

血紅蛋白具有四個亞基組成的四級結構，每個亞基中間有一個疏水局部，可攜帶一個血紅素并攜帶一分子氧，因此1分子Hb共結合四分子氧。Hb各亞基的三級結構與Mb極為相似。Hb亞基之間通過八對鹽鍵，使四個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。Hb與Mb一樣能可逆地與O2結合，Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。2、血紅蛋白的構象變化與結合氧

*協同效應(cooperativity)

一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現象，稱為協同效應。如果是促進作用則稱為正協同效應(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應

(negativecooperativity)抗體——生物體內最奇妙的分子無限的多樣性（diversity)功能與結構的雙重性

可變區(qū)——抗原結合恒定區(qū)——生物學效應功能（二）免疫球蛋白的結構與功能（1）抗體的基本結構Ig分子基本結構是由四個肽鏈組成的。包括二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈。輕鏈與重鏈之間是由二硫鍵連接形成Ig分子單體。

（1）抗體的基本結構（2）可變區(qū)和恒定區(qū)可變區(qū)和抗原識別有關，決定抗體識別的特異性，而恒定區(qū)和效應功能相關。此外在Y形分子伸出的兩臂和主干之間還有個可彎曲的鉸鏈區(qū)(hingeR)，能改變兩個結合抗原的Y形臂之間的距離。兩臂之間的角度可有自0°到90°的變化，這樣有利于兩臂同時結合位于抗原上分布于不同位置的表位。鉸鏈區(qū)Ig的鉸鏈區(qū)及其功能（三）蛋白質構象改變與疾病

蛋白質構象疾?。喝舻鞍踪|的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。蛋白質構象改變導致疾病的機理：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第六節(jié)蛋白質的性質與分離、分析技術一、蛋白質的性質相對分子質量很大，一般介于10000-1000000道爾頓之間，也有更大的。測定分子量的方法很多：滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（一）蛋白質相對分子質量（二）蛋白質的兩性性質及等電點蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點。

各種蛋白質有特定的等電點，和它所含的氨基酸種類和數量有關。例：含有堿性氨基酸較多，則pI偏堿（偏大）含有酸性氨基酸較多，則pI偏酸（偏?。?；含有酸、堿氨基酸數目相近時，pI為中性偏酸，約為5.0左右。

pH>pI，蛋白質帶負電，體內蛋白質的pI大多為5.0左右，故生理條件下一般以負離子形式存在。

蛋白質酸性氨基酸數堿性氨基酸數pI胃蛋白酶3761.0胰島素445.35RNA酶10187.8細胞色素c12259.8～10.8等電點時，蛋白質以兩性離子存在，最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出（用于蛋白質的分離提純）；蛋白質的粘度、滲透壓、膨脹性以及導電能力均最小。（三）蛋白質的變性與復性*蛋白質的變性(denaturation)在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞（即有序的空間結構變成無序的空間結構），從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。造成變性的因素物理因素：加熱、紫外線、X線、超聲波化學因素：乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——

破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。變性特征：

生物活性喪失；

理化性質改變：溶解度降低、球狀蛋白質的不對稱性增加、粘度增加、擴散系數降低，某些蛋白質不能夠再形成結晶,變性后分子結構松散、易被水解，變性蛋白易被酶消化。組成和相對分子質量不變若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性。蛋白質的復性(renaturation)

Anfinsen實驗

-牛胰核糖核酸酶的變性和復性結論：蛋白質的變性是可逆的；一級結構決定三維結構；形成三維結構所需要的所有信息都包含在一級結構中。（四）蛋白質的膠體性質

蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。*蛋白質膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩(wěn)定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉蛋白質由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中能成為穩(wěn)定的膠體。如果在蛋白質溶液中加入某種電解質或調節(jié)溶液pH，破壞了蛋白質的水化膜及中和了蛋白質的電荷，則蛋白質從溶液中析出的作用，稱為蛋白質的沉淀作用。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。根據反應的可逆性分為可逆沉淀和不可逆沉淀兩種。（五）蛋白質的沉淀反應1、可逆的沉淀作用定義：蛋白質發(fā)生沉淀后，用透析等方法除去沉淀劑，可使蛋白質重新溶于原來的溶液中。在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀?？赡娉恋硎欠蛛x和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。反應類型：（1）加高濃度鹽類

:如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等

鹽析：加鹽使蛋白質沉淀析出的現象不同的蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，調節(jié)鹽濃度可將混合蛋白質分段析出（分段鹽析）。例：

半飽和的(NH4)2SO4可使球蛋白沉淀；飽和的(NH4)2SO4可使清蛋白析出。

應用：利用此性質可分離和制備各種蛋白質和酶制品（2）加有機溶劑：如酒精、丙酮等 機理：有機溶劑和水有較強的作用，破壞了蛋白質分子周圍的水膜，因此發(fā)生沉淀反應。（3）等電點沉淀

利用蛋白質的兩性性質，在等電點時溶解度最小的特點。在pI時，加入這些有機溶劑可加速蛋白質的沉淀，可用于蛋白質的分離純化。定義：蛋白質發(fā)生沉淀后，不能用透析等方法除去沉淀劑而使蛋白質重新溶解的現象在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。2、不可逆沉淀（六）蛋白質的顏色反應1、雙縮脲反應(biuretreaction)蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。2、米倫氏反應（酚基）

米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質溶液加入此試劑后即產生白色沉淀，加熱后沉淀變?yōu)榧t色。酪氨酸含有酚基，故含酪氨酸的蛋白質都有此反應。3、乙醛酸反應（吲哚基）

在蛋白質溶液中加入乙醛酸，并沿試管壁慢慢注入濃硫酸，在兩層之間就會出現紫色環(huán)。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質有此反應。4、坂口反應精氨酸分子含有胍基，能與次氯酸鈉及α-萘酚在氫氧化鈉溶液中產生紅色產物。5、酚試劑（福林試劑）反應酪氨酸中的酚基能將福林試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物。

該反應常用蛋白質的定量測定。（五）蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。前處理及抽提：選材、破碎、勻漿、溶解、離心或差速離心、（pH、溫度、酶的抑制劑等保證蛋白質的穩(wěn)定）。粗制品獲得（粗分級分離）：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑分級分離，離心。純化（細分級分離）：層折法。鑒定和測定：純度和含量。二、蛋白質的分離和分析技術（一）蛋白質分離純化的一般原則1、透析及超濾*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。只用于除鹽類和小分子雜質（二）常見分離純化技術透析(dialysis):磁力攪拌器透析前透析后透析袋通過透析，小分子通過透析袋，散布于透析液中，大分子量的蛋白質不能通過透析袋，留在透析袋內。從而，蛋白質溶液中的小分子物質通過透析被分離除去。超過濾（ultrafiltration）加壓蛋白質溶液半透膜支持膜的柵板超濾液原理:是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質留在半透膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的2、鹽析和鹽溶*鹽析(saltprecipitation)：將高濃度的中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。鹽溶（saltsolution）：低濃度的中性鹽可以使蛋白質溶解度增加。等電點沉淀法：不同蛋白質、氨基酸組成不同，等電點不同，可利用等電點沉淀方法進行分離。等電點特點：蛋白溶解度最低3、等電點沉淀法4、低溫有機溶劑沉淀法*常用有機溶劑：乙醇、丙酮*丙酮沉淀：使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離，否則蛋白易變性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。以上幾種方法只能分離得到蛋白質的粗制品，還無法得到具有一定純度的蛋白質。5、電泳—根據電荷不同進行純化的方法蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術,稱為電泳(elctrophoresis)。根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

原點帶負電荷蛋白質的泳動方向濾紙、醋酸纖維素薄膜或其他支持物陽極陰極電極緩沖液電極緩沖液電泳示意圖薄膜電泳幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳，以上兩種方法相結合，是蛋白質組學研究的重要技術。凝膠電泳（四）層析（色譜）層析(chromatography)分離蛋白質的原理當流動相帶著待分離蛋白質溶液經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的。蛋白質分離常用的層析方法*離子交換層析：利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析、分子排阻