實驗大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

實驗大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第一頁，共三十八頁，2022年，8月28日什么是微生物？乳酸桿菌黑曲霉微生物：結(jié)構(gòu)簡單、形體微小的單細(xì)胞、多細(xì)胞或沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的低等生物。第二頁，共三十八頁，2022年，8月28日什么是培養(yǎng)基？三角瓶培養(yǎng)皿試管液體培養(yǎng)基：擴(kuò)大培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)。固體培養(yǎng)基：分離純化，鑒定菌種，計數(shù)，保藏。凝固劑：瓊脂第三頁，共三十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)基的配制營養(yǎng)成分功能和來源碳源氮源生長因子水無機(jī)鹽提供碳元素：主要是糖類提供氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素維生素、氨基酸和含氮堿基H2O，良好的溶劑NaCl：維持一定的滲透壓第四頁，共三十八頁，2022年，8月28日LB培養(yǎng)基的配制LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50mL，瓊脂1g。調(diào)節(jié)pH至7.6。封口膜第五頁，共三十八頁，2022年，8月28日菌落：單細(xì)菌的克隆菌落：在固體培養(yǎng)基上，由單個細(xì)菌繁殖而來的一個肉眼可見的具有特定形狀的子細(xì)胞群體。霉菌大腸桿菌第六頁，共三十八頁，2022年，8月28日菌落的作用：鑒定菌種的重要依據(jù)菌落特征：菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。第七頁，共三十八頁，2022年，8月28日大腸桿菌大腸桿菌：革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌。第八頁，共三十八頁，2022年，8月28日怎樣無菌操作？高壓蒸汽滅菌：培養(yǎng)皿、試管、三角瓶、槍頭、玻璃三角刮刀、接種環(huán)、鑷子。在121℃下滅菌15min。高壓蒸汽滅菌鍋第九頁，共三十八頁，2022年，8月28日培養(yǎng)皿三角瓶玻璃三角刮刀接種環(huán)微量移液器槍頭第十頁，共三十八頁，2022年，8月28日棉花塞、封口膜、牛皮紙或舊報紙、橡皮筋不能用脫脂棉：易吸水，容易引起污染。第十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日酒精燈和酒精棉球滅菌：殺死所有微生物。消毒：殺死部分微生物（不包括芽孢和孢子）。第十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日超凈工作臺①打開紫外燈和過濾風(fēng)，滅菌30min。②點燃酒精燈→酒精棉擦拭桌面→酒精棉球擦手。酒精燈火焰附近旁進(jìn)行灼燒滅菌防止雜菌污染第十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日用細(xì)菌過濾器除菌：尿素加熱會分解，用G6玻璃砂漏斗過濾。第十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日什么是倒平板？將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后制成的培養(yǎng)基。第十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日Step1：培養(yǎng)基的配制和滅菌①將50mLLB液體培養(yǎng)基、50mLLB固體培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。無菌水培養(yǎng)皿用牛皮紙包扎第十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日Step2：倒平板②在酒精燈火焰旁將三角瓶中的固體培養(yǎng)基（冷卻到60℃）倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，置于水平放置上，并輕輕晃動，待凝固后形成平面。超凈臺第十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日Step3：接種后擴(kuò)大培養(yǎng)③將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中，使其在37℃搖床培養(yǎng)12h

。恒溫?fù)u床第十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日Step4：平板劃線分離④用接種環(huán)在培養(yǎng)大腸桿菌的三角瓶中蘸取菌液一次，在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線。將培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫箱中培養(yǎng)12～24h。第十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日怎樣在平板上劃線？1次2次3次4次連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法第二十頁，共三十八頁，2022年，8月28日原因：隨著劃線次數(shù)的增加，菌數(shù)越來越少，最終在劃線的末端出現(xiàn)由一個細(xì)菌繁殖而來的單個菌落。為什么通過劃線分離可得到單菌落？第二十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日原因：既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基中造成污染。恒溫培養(yǎng)時培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)皿倒置皿蓋皿底恒溫培養(yǎng)箱第二十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日Step5：菌種的斜面保存⑤將接種環(huán)將單菌落取出，用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，置于4℃冰箱中保存。斜面培養(yǎng)基第二十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日試管斜面培養(yǎng)基的制作方法：將未凝固的含有瓊脂的培養(yǎng)基加入試管中，滅菌后將試管斜放，令其冷卻，固體培養(yǎng)基即成為斜面。第二十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日平板劃線分離法①灼燒接種環(huán)外焰先灼燒后冷卻：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。第二十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日②接種環(huán)冷卻后，蘸取帶菌培養(yǎng)物第二十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日③在近火焰處，讓帶菌接種環(huán)在固體培養(yǎng)

基上劃線第二十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日④恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)分區(qū)劃線法每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)。總是從上一次劃線的末端開始劃線。第二十八頁，共三十八頁，2022年，8月28日稀釋涂布分離法①用無菌吸管吸取1mL細(xì)菌培養(yǎng)液加入另一個盛有9mL無菌水的試管中，混合均勻，以此制成10-1倍的稀釋液。①梯度稀釋菌液：10-5~10-7倍第二十九頁，共三十八頁，2022年，8月28日②滴加菌液②用無菌吸管取0.1mL稀釋度不同的菌液，加在培養(yǎng)皿的固體培養(yǎng)基上。第三十頁，共三十八頁，2022年，8月28日③用玻璃刮刀涂布玻璃涂棒第三十一頁，共三十八頁，2022年，8月28日③將玻璃刮刀放在酒精燈火焰上灼燒，待玻璃刮刀冷卻后，在酒精燈旁打開培養(yǎng)皿，將菌液涂布到整個培養(yǎng)基表面。第三十二頁，共三十八頁，2022年，8月28日④將培養(yǎng)皿倒置，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48h。④恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱第三十三頁，共三十八頁，2022年，8月28日結(jié)果：以每個培養(yǎng)皿中有20個以內(nèi)的單菌落最為合適。10-110-210-310-410-5第三十四頁，共三十八頁，2022年，8月28日第三十五頁，共三十八頁，2022年，8月28日倒平板平板劃線分離練一練，識一識稀釋涂布分離接種環(huán)玻璃刮刀第三十六頁，共三十八頁，2022年，8月28日例題：要獲得遺傳特性單一的大腸桿菌菌種，一般必須對原有的大腸桿菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并利用純化技術(shù)得到單菌落的菌種。請回答下列有關(guān)大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗的相關(guān)問題：（1）對買回來的大腸桿菌菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，一般用LB培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中為微生物提供碳源、氮源和能源的物質(zhì)主要是

，為調(diào)節(jié)滲透壓，要加入一定量的

。為進(jìn)行大腸桿菌的分離，還要加入

配制成固體培養(yǎng)基，并進(jìn)行倒平板的操作。蛋白胨和酵母提取物氯化鈉瓊脂第三十七頁，共三十八頁，2022年，8月28日（2）獲得純凈微生物培養(yǎng)物的關(guān)鍵是

，為此，必須對培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基進(jìn)行嚴(yán)格滅菌。培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基一般采用

法滅菌，接種環(huán)采用灼燒法滅菌。同時在接種或倒平板操作時，除了在超凈臺上進(jìn)行操作并對實驗者的衣著、手和實驗空間進(jìn)行嚴(yán)格清潔和消毒外，還必須

以防止空氣中的雜菌污染。（3）大腸桿菌菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)一般采用液體培養(yǎng)基，接種后將培養(yǎng)基置于37℃搖床振蕩條件下培養(yǎng)12h。菌種的分離一般在固體培養(yǎng)基上采用

法，并