微生物學：11結核分枝桿菌屬

分枝桿菌屬Mycobacterium

是一類細長略彎的桿菌，除二分裂繁殖外,尚有分枝生長的趨勢，故名分枝桿菌。態(tài)生兩靨之愁，嬌襲一身之病。淚光點點，嬌喘微微。閑靜時如姣花照水，行動時如弱柳扶風。癆病

本屬菌的共同特點：

無芽胞，無鞭毛，某些菌株有莢膜，有分枝生長趨勢;細胞壁脂質含量高，主要為分枝菌酸；為G+b,但不易著色，抗酸染色陽性，故又名抗酸桿菌（acid-fast-bacillus）；專性需氧，營養(yǎng)要求高，大多生長緩慢；不產生內外毒素及侵襲性酶類，其致病性與菌體成分以及機體對菌體成分所產生的免疫損傷有關；所致疾病呈慢性過程。分類

放線菌目→分枝桿菌科→分枝桿菌屬：種類繁多，已發(fā)現(xiàn)80多個種。國際分類研究組（IWGMT）分為三類（表14-1）1.結核分枝桿菌群（緩慢生長菌）（1）人結核分枝桿菌：感染率高，占90%，對人致病，與牛結核分枝桿菌有交叉免疫。（2）牛結核分枝桿菌：感染率次之，對人致病。（3）非洲結核分枝桿菌：1968年從非洲肺結核病人的痰中分離出（4）田鼠分枝桿菌：對人一般不致病

2．非典型分枝桿菌（緩慢生長或快速生長菌）

除結核與麻風分枝桿菌以外的結核分枝桿菌（1）Ⅰ群（緩慢生長菌）：致機會肺部感染或游泳池肉芽腫（2）Ⅱ群（緩慢生長菌）：致兒童淋巴腺炎或成人肺部感染（3）Ⅲ群（緩慢生長菌）：致AIDS患者機會感染或肺部類結核感染（4）Ⅳ群（快速生長菌）：致局部和肺部類結核感染，軟組織和手術后繼發(fā)感染3．麻風分枝桿菌（不能培養(yǎng)菌）

目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長，致人類麻風病，為慢性傳染病，主要侵犯深部組織和器官。目前對小鼠足墊接種成功，對犰狳易感,可作為研究的動物模型。微生物學診斷主要靠涂片，抗酸染色鏡檢，金胺O熒光染色鏡檢或病理活檢。

分枝桿菌屬其模式菌株為人結核分枝桿菌，標準菌株為ATCC27294。

結核分枝桿菌

M.tuberculosis

一．微生物特性形態(tài)染色細長略彎的桿菌,有時可見分枝狀，可出現(xiàn)多形態(tài):球形、串珠狀或絲狀。革蘭染色陽性,但不易著色,抗酸染色陽性,經齊-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色,菌體呈紅色,其他細菌和背景物質呈藍色,用金胺O熒光染色→菌體呈金黃色熒光。本菌無鞭毛,無芽胞,有莢膜,但因制片破壞不易看到。培養(yǎng)特性

本菌為專性需氧菌,3%-5%的CO2可促進其生長。最適PH6.5-6.8,最適生長溫度為370C。營養(yǎng)要求高，必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油、無機鹽和孔雀綠等的羅-琴（Lowenstein-Jensen,L-J）固體培養(yǎng)基

才能生長良好，因蛋清含脂質生長因子，能刺激結核分枝桿菌生長，孔雀綠能抑制雜菌生長，故有利于本菌的分離培養(yǎng)與保存。該菌生長緩慢（18h/代）一般2-5周方長出菌落，菌落呈R型：表面粗糙、干燥、隆起、堅硬、呈顆粒狀、結節(jié)狀或花菜狀，乳白色或淡黃色，不透明。在液體培養(yǎng)基中生長較為迅速，一般1-2周即可生長，呈菌膜生長，有毒力的菌株呈索狀生長。若液體培養(yǎng)基中加入0.2%吐溫-80（Tween-80）則可呈均勻生長。結核桿菌培養(yǎng)3.菌體成分—脂質、多糖和蛋白質1)脂質此菌含有大量脂質，占CW干重的60%,包括磷脂、脂肪酸和蠟質。其中蠟質所占比例最大,由分枝菌酸、索狀因子、蠟質D組成.2)蛋白質本菌含有多種蛋白質,結核菌素(tuberculin)就是其中之一,與蠟質結合能使機體致敏,產生超敏反應,引起組織壞死和全身中毒癥狀,并與結核結節(jié)的形成相關．蛋白質也可刺激機體產生非保護性抗體.3）多糖TB含有各種多糖,其致病作用不清.

莢膜主要成分為多糖及部分脂質和蛋白質．它能與吞噬細胞表面的補體受體3(CR3)結合,有助于粘附與入侵;莢膜中的多種酶可降解宿主組織中的大分子物質,為本菌生長繁殖提供所需的營養(yǎng)物質;

莢膜能防止宿主的有害物質進入本菌;莢膜尚可抑制巨噬細胞中的吞噬體與溶酶體的融合,故與致病性密切相關．

生化反應

本菌生化反應不活潑,不發(fā)酵糖類．多數(shù)菌株觸酶試驗陽性,但熱觸酶試驗陰性,而非典型分枝桿菌熱觸酶試驗大多陽性．結核分枝桿菌煙酸試驗及硝酸鹽還原試驗均呈陽性,而牛分枝桿菌均為陰性,有助于鑒別．

人結核分枝桿菌非典型分枝桿菌牛結核分枝桿菌觸酶試驗+熱觸酶試驗-+煙酸試驗+-硝酸鹽還原試驗+-變異性1）形態(tài)變異：

細長桿菌L型（Much顆粒）:

顆粒狀或者絲狀形,抗酸性下降或消失

2）菌落變異:

R型菌落(有毒菌株)S型(無毒菌株)

不良環(huán)境藥物影響不良環(huán)境藥物影響3）毒力變異:

有毒牛型結核分枝桿菌

減毒活疫苗(毒力大大下降,抗原性不變),1908年由BacilleCalmette-Guerin發(fā)現(xiàn)→BCG(卡介苗)4）耐藥性變異:結核分枝桿菌耐藥性變異（MDRTB）耐藥菌株毒力明顯減弱,但近年來多重耐藥菌株逐漸增多,其TB病的死亡率高達７２％－８９％（USCDC），甚至引起爆發(fā)流行,給結核病的防治帶來巨大困難.

藥物選擇(繼發(fā)耐藥)基因突變(原發(fā)耐藥)13年230代L-J培養(yǎng)基抵抗力(三耐五敏)耐干燥:在干燥痰中可存活6-8個月,在含痰液的塵埃中可存活8-10天,故不能隨便吐痰。耐酸堿:在3%HCI、6%H2SO4、4%NaOH中30min其活力不受影響,故常用此法來處理被雜菌污染的標本。耐某些染料及抗生素:對1:13000孔雀綠、1:7500結晶紫、青霉素等有一定抵抗力,故在培養(yǎng)基中可加入這些物質抑制標本中的雜菌生長,而不影響結核分枝桿菌生長,從而有利于初代分離培養(yǎng)。對75%的酒精敏感,常用于消毒病人口溫表;對濕熱敏感,濕熱62-630C15min或者煮沸即被殺滅,故常用巴氏法消毒牛奶或用煮沸法消毒結核病人的餐具;對紫外線(日光)敏感:常用于消毒結核病房空氣和病人衣物等;對某些化學消毒劑敏感,但需延長消毒時間:如5%石炭酸24小時,3%來蘇爾1-2小時,方能殺滅痰內的結核桿菌;對抗癆藥物敏感:異煙肼、鏈霉素、對氨基水楊酸(PAS)、利福平、乙胺丁醇、卡那霉素等,常用于結核病的治療.抵抗力總結：四不怕◆對干燥的抵抗力特別強◆結核分枝桿菌對酸（3%HCl或6%H2SO4)或堿（4%NaOH)有抵抗力，15min不受影響◆對堿性染料有抵抗力◆對青霉素等抗生素耐藥四怕◆對乙醇敏感——在70%乙醇中2min死亡◆對濕熱敏感——62～630C15min殺死（巴氏消毒）◆對紫外線敏感◆對鏈霉素、異煙肼、利福平、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、對氨基水楊酸等抗癆藥物敏感，但長期用藥容易出現(xiàn)耐藥性二.臨床意義致病物質------CW上莢膜、蛋白質、脂質與致病性密切相關．所致疾病------結核病,以肺結核最為多見.傳染源:開放性肺結核病人,病灶與外界相通,不斷向體外排出結核分枝桿菌,經過塵?；蝻w沫吸入肺泡,被巨噬細胞吞噬,在其中發(fā)育繁殖,導致病變產生.傳染途徑:主要通過呼吸道、消化道和受損的皮膚粘膜等途徑→易感機體.部分結核分枝桿菌→血液→肺內、外播散→肺內外感染：肺結核、結核性腦膜炎、腎結核、骨結核、關節(jié)結核、生殖道結核等多種臟器組織的結核病(粟粒性結核),但有不少學者認為沿血液播散的結核分枝桿菌為該菌的L型.易感機體:未接種過卡介苗或機體免疫功能低下者.初次感染TB→原發(fā)性結核,多見于兒童,病灶多位于肺門部,且多為外源性感染,易形成原發(fā)綜合癥.再次感染TB→繼發(fā)性結核,多見于成年人,病灶多位于肺尖部,既可內源性感染復發(fā),也可為外源性新侵入的結核引起.

結核病至今仍為重要的傳染病,據(jù)WHO估計,目前全球約1/3的人口感染過結核分枝桿菌,每年約有800萬-1000萬新發(fā)病例,每年至少有300萬人死于結核病,相當于每天有8000人死于結核病,其中98%的病死率在發(fā)展中國家.20世紀80年代以來,隨著AIDS發(fā)病率的增加,耐藥性TB的不斷增加,以及吸毒、免疫抑制劑的應用等原因,結核病的發(fā)病率出現(xiàn)了世界范圍的回升。如果不加強結核病的防治,從2000-2020年,全球有10億新結核感染者,其中約有2億人發(fā)病,7000萬人死亡.結核病已成為傳染病中的頭號殺手和最大死亡原因之一,被稱為“白色瘟疫”,全球目前已處于結核病的緊急狀態(tài).

新中國成立后隨著人民生活水平的提高,衛(wèi)生狀況的改善,特別是開展了群防群治,兒童普遍接種卡介苗,結核病的發(fā)病率和死亡率也大為降低,但近20年以來結核病的發(fā)病率又普遍增高,應引起我們高度的重視。免疫性—以CMI為主（

cell-mediatedimmunity）

結核的感染率高（80%-90%），但發(fā)病率低（4%±），多為隱性感染。說明人體對TB有相當強的免疫力。結核分枝桿菌是細胞內感染菌，主要以TL為主的細胞免疫。致敏TL+TB→淋巴因子：IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α…..共同作用殺死病灶中的結核分枝桿菌。結核的免疫屬于傳染性免疫（infectiveimmunity）,又稱有菌免疫，即只有在體內存在結核分枝桿菌或菌體成分時，機體才對再次入侵的TB有免疫力，反之則無免疫力。機體對TB的傳染、免疫和遲發(fā)型超敏反應同時存在，可測其一而知其二。常用結核菌素（tuberculin）皮膚試驗來檢測機體對TB是否有免疫力。

郭霍現(xiàn)象（Kochphenomenon）:有毒TB初次感染GP，10－14天后注射局部潰爛、壞死，附近LN腫大，細菌擴散漫延至全身，甚至死亡。有毒TB再次感染GP，1－2天內注射局部迅速潰爛，但很快愈合，且不擴散至附近LN和全身。說明機體對結核分枝桿菌所產生的CMI和超敏反應是同時存在的，是由不同的菌體成分激活不同的T細胞亞群釋放出不同的細胞因子所引起的?，F(xiàn)一般認為超敏反應是由結核菌素蛋白和臘質D共同引起的，而CMI是由結核分枝桿菌核糖體RNA(rRAN)引起。三.微生物學檢驗（一)檢驗程序圖14-1(二)標本采集

根據(jù)感染部位不同分別采取痰液(晨痰)、支氣管灌洗液、胸腹水、腦脊液(靜置后，試管表面可有細薄凝塊)、尿(晨尿或24小時尿取沉淀物10－15ml,診斷尿路結核需采集3－5份標本)、糞便（國外一般不做）、分泌物與組織等。

(三)檢驗方法

1.顯微鏡檢查

直接涂片染色鏡檢：是一種常用的簡易快速檢查法。標本直接涂片(一接種環(huán)或0.01ml)或濃縮集菌(漂浮法、沉淀法)后厚涂片(3-4接種環(huán)，約0.1ml，面積1.5cm2)，經干燥固定后做齊-尼抗酸染色(熱染法)或金胺’O’熒光染色。抗酸染色，用油鏡觀察，結核分枝桿菌呈紅色。金胺’O’染色后用熒光顯微鏡HP鏡觀察，結核分枝桿菌呈金黃色熒光。每張涂片至少觀察300個視野。

ThisisanacidfaststainofMycobacteriumtuberculosis(MTB).Notetheredrods--hencetheterminologyforMTBinhistologicsectionsorsmears:acidfastbacilli.組織中結核分枝桿菌(抗酸染色)結核分枝桿菌金胺’O’染色后用熒光顯微鏡HP鏡觀察Mycobacteriacanalsobestainedwithauramineandviewedwithfluorescencemicroscopy,inwhichacidfastbacillinowappearasglowingyellowrods.Thismethodiseasiertousetoscreenformycobacteriaandisthemethodroutinelyusedinsputumspecimenssenttothelaboratory.報告方式：“找到抗酸性桿菌”或“未找到抗酸性桿菌”。具體報告方式可用1984年國內統(tǒng)一暫定的厚涂片法填寫報告單：表14-3染色方法

鏡檢結果

報告方式

抗酸染色(×1000)

未發(fā)現(xiàn)抗酸菌(至少１00個oil視野)－1-2個抗酸菌/300個oil視野±3-9個抗酸菌/100個oil視野+1－9個抗酸菌/10個oil視野++1－9個抗酸菌/1個oil視野+++≥10個抗酸菌/1個oil視野++++熒光染色(×450)

未發(fā)現(xiàn)抗酸菌(至少１00個視野)－1-2個抗酸菌/70個視野±2-18個抗酸菌/50個視野+4－36個抗酸菌/10個視野++4－36個抗酸菌/1個視野+++

＞36個抗酸菌/1個視野++++染色方法

鏡檢結果

報告方式

另直接涂片法也可用全視野發(fā)現(xiàn)1-4個GⅠGaffky報告法(GⅠ-GⅩ)

數(shù)視野發(fā)現(xiàn)1個GⅡoil視野

平均每視野內有1個GⅢ平均每視野內有2-3個GⅣ平均每視野內有4-6個GⅤ平均每視野內有7-12個GⅥ平均每視野內有13-25個GⅦ平均每視野內有26-50個GⅧ平均每視野內有100個GⅨ平均每視野內有100個以上GⅩ2.核酸檢測

用PCR法(尤其是定量PCR法)或核酸探針可快速診斷結核分枝桿菌感染。其特異性與敏感性均>95%(可達100％)。3.色譜分析技術

因不同分枝桿菌的細胞壁中的分枝菌酸含量不同，故可利用氣液相色譜(HPLC)分析不同分枝桿菌的脂肪酸，可進行菌種鑒定，具有快速、微量、敏感性高等特點。4.免疫學診斷

(1)抗PPDIgG檢測：用PPD(純蛋白衍生物)為抗原，用ELISA法檢測結核病人血清中的抗PPDIgG，可作為活動性結核分枝桿菌感染的快速診斷，其敏感性為60％-80％，特異性約90％，肺結核病人的血清陽性率為80％-90%.(2)結核菌素試驗(tuberculintest):

是利用結核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結核分枝桿菌是否產生遲發(fā)性變態(tài)反應的一種試驗。結核菌素是結核分枝桿菌的菌體成分，可分為兩種：一種是舊結核菌素(oldtuberculin,OT),另一種是純蛋白衍生物(purifiedproteinderivative,PPD)包括：結核分枝桿菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD兩種，每0.1ml含5個單位，目前均用PPD.

原理：結核分枝桿菌的感染、免疫、變態(tài)反應三者同時存在，所以可用PPD來做皮膚試驗，看局部皮膚有無變態(tài)反應，從而推測機體是否有傳染和免疫。

方法與結果判斷：取0.1mlPPD(含5u)前臂皮內注射，48－72小時后.局部紅腫硬結>5mm者為陽性。表明機體可能感染過結核分枝桿菌或接種過卡介苗，但不一定患結核病；局部紅腫硬結>15mm為強陽性，表明機體可能有活動性結核，應進一步檢查；局部紅腫硬結<5mm為陰性，表明未感染過結核分枝桿菌，但應排除原發(fā)性結核病的早期、老年人、嚴重結核病(如粟粒性TB、結腦)或有其它嚴重疾病(如麻疹、淋巴瘤、白血病、AIDS)以及免疫抑制劑應用者。

用途：①可作流行病學調查,了解人群對結核分枝桿菌的感染率。②選擇BCG接種的對象及接種的效果。③可作為嬰幼兒(<3歲)結核病診斷的參考指標。④可測定腫瘤病人的細胞免疫功能。結核菌素試驗陽性(3)全血干擾素測定法：

當全血＋PPD/植物血凝素共同孵育后，致敏LC可分泌IFN-γ，通過檢測IFN-γ的含量來鑒定菌種。本試驗的結果與結核菌素試驗相當，且受BCG接種史影響小，又能與非結核分枝桿菌進行區(qū)分，同時尚可避免結核菌素試驗在操作上與結果判斷上存在的多種主觀或人為因素的影響。

5.分離培養(yǎng)(1)標本前處理：結核病人的痰或其它標本大多含有雜菌，在培養(yǎng)前可用4％NaOH、4％H2SO4、胰酶-新潔爾滅法等對標本進行處理，以達到殺滅雜菌或減少雜菌和液化痰標本的目的。