《獸醫(yī)學(xué)》實(shí)驗(yàn)課

實(shí)驗(yàn)三常見(jiàn)毒物亞硝酸鹽定性檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求了解毒物定性檢驗(yàn)的基本原理、毒物的性質(zhì)。熟練地掌握毒物的檢測(cè)方法，懂得運(yùn)用定性檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合臨床、綜合分析對(duì)動(dòng)物中毒作出較為確切的判定。二、實(shí)驗(yàn)方法與步驟動(dòng)物亞硝酸鹽中毒，多數(shù)是采自亞硝酸鹽含量很高的飼料而發(fā)生。將新鮮白菜切碎置于10℃氣溫下，自然風(fēng)干腐爛，在2～3d內(nèi)亞硝酸鹽含量略有增加，第4天急劇上升至190mg/kg，第7天達(dá)到最高（2609mg/kg）。將這種切碎的新鮮白菜置于37℃保溫時(shí)，第2天亞硝酸鹽的含量急劇上升達(dá)最高值（504mg/kg），出現(xiàn)亞硝峰。青飼料在鍋里微火慢煮時(shí)，經(jīng)硝化菌作用，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化最快、最多。（一）聯(lián)苯胺－冰醋酸法【原理】

亞硝酸鹽在酸性溶液中將聯(lián)苯胺重氮化成一種醌式化合物而呈現(xiàn)棕紅色?！驹噭?/p>

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g聯(lián)苯胺溶于10mL冰醋酸中，加水稀釋至100mL過(guò)濾制成聯(lián)苯胺－冰醋酸試劑。（一）聯(lián)苯胺－冰醋酸法【操作方法】取碾碎的飼料樣或切碎的青飼料，或取可疑的剩余飼料、嘔吐物或胃內(nèi)容物5～10g，置于100mL帶塞三角瓶中，加70℃熱水30～50mL，放置10～15min，過(guò)濾液作待檢液。取檢液2滴，置白瓷板上或小試管中，加1滴聯(lián)苯胺－冰醋酸試劑，如有亞硝酸鹽存在，出現(xiàn)紅棕色、同時(shí)作陽(yáng)性（亞硝酸空白）或陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。（二）安替比林法【原理】

亞硝酸鹽在酸性溶液中將使安替比林亞硝基代，溶液里綠色?！驹噭?g安替比林溶于100mL1mol/L硫酸（30ml濃硫酸緩慢進(jìn)入適量蒸餾水中，冷卻至室溫，并稀釋至100ml）中制成安替比林試劑。（二）安替比林法【操作方法】

取檢液1滴，置于白瓷板上滴加1滴安替比林試劑，若出現(xiàn)綠色，示有亞硝酸鹽存在。

由于微量亞硝酸鹽，自然界廣泛存在，加之定性檢驗(yàn)方法顯色的靈敏度高。因此在必要的情況應(yīng)進(jìn)行定量檢驗(yàn)，方可判定亞硝酸鹽中毒。實(shí)驗(yàn)四酮體檢測(cè)

酮體包括乙酰乙酸、β－羥丁酸和丙酮，前二者是脂質(zhì)代謝的中間代謝產(chǎn)物，后者是一種剩余物。當(dāng)碳水化合物缺乏時(shí)，酮體的產(chǎn)生增多，此時(shí)糖異生作用增強(qiáng)。在這種情況下，在三羧酸循環(huán)中草酰乙酸缺乏，導(dǎo)致乙酰輔酶A增多，后者則是生酮的先質(zhì)。酮體的腎閾值較低，故在測(cè)出酮血癥之前，通常就已出現(xiàn)酮尿。一、酮體的定性試驗(yàn)

通常采用亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)。該反應(yīng)對(duì)乙酰乙酸是特異性的，對(duì)丙酮也有一些反應(yīng)，但對(duì)β－羥丁酸不起反應(yīng)，而β－羥丁酸在酮血癥中占主要成分，因此反應(yīng)程度與酮病的嚴(yán)重程度并無(wú)一致的關(guān)系。該方法簡(jiǎn)便易行，可用酮粉法或配置的液體試劑測(cè)定奶、尿或血清樣品。一、酮體的定性試驗(yàn)酮粉配制：取硫酸銨100g，無(wú)水碳酸鈉50g，亞硝基鐵氰化鈉3g，研碎混勻備用。操作方法：在短試管內(nèi)或凹狀試板上加酮粉試劑1g，滴加被檢樣品，數(shù)分鐘后呈高錳酸鉀樣紅色為陽(yáng)性反應(yīng)。在乳牛場(chǎng)內(nèi)，可對(duì)乳牛于產(chǎn)前1周至產(chǎn)后5周的時(shí)間內(nèi)，每周2次測(cè)定尿液pH值和尿液或乳中酮體，pH值呈酸性或酮體呈陽(yáng)性應(yīng)予以注意，采用碳酸氫鈉、葡萄糖等治療。二、酮體的定量試驗(yàn)

微量凱氏蒸餾、水楊醛比色法。該法可測(cè)得全量酮體。樣品以氫氧化鋇和硫酸鋅去除蛋白，其中丙酮首先被蒸餾分離，乙酰乙酸和β－羥丁酸經(jīng)先后加入硫酸和重鉻酸鉀氧化，變成丙酮而蒸餾，蒸餾液與芳香族醛在堿性條件下發(fā)生紅色反應(yīng)?！就w的臨床意義】

出現(xiàn)酮血癥或酮尿癥，表明機(jī)體脂肪和能量代謝紊亂。常見(jiàn)于奶牛酮病、綿羊妊娠毒血癥、母牛肥胖綜合征、真胃變位、糖尿病性酮酸中毒、長(zhǎng)期饑餓等。實(shí)驗(yàn)五動(dòng)物血清轉(zhuǎn)氨酶的測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求初步掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測(cè)定的實(shí)驗(yàn)條件、方法和步驟。了解本次所測(cè)定血清酶的臨床意義。血清ALT的測(cè)定血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）作用于丙氨酸及α-酮戊二酸組成的基質(zhì)，產(chǎn)生丙酮酸及谷氨酸。【原理】血清ALT的測(cè)定丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，再與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，計(jì)算出酶的單位。血清ALT的測(cè)定【試劑】0.1mol/L磷酸氫二鈉：磷酸氫二鈉（含兩個(gè)結(jié)晶水）17.6g溶解于水中，并加水1000ml，冰箱內(nèi)保存。0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀13.6g溶解于水中，加水至1000ml，冰箱內(nèi)保存。0.1mol/L磷酸緩沖液（pH7.4）：將420ml0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液和80ml0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液混勻，置冰箱內(nèi)保存。血清ALT的測(cè)定基質(zhì)緩沖液（DL-丙氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：精確稱(chēng)取1.79gDL-丙氨酸和29.2mgα-酮戊二酸，先溶于約50ml0.1mol/L磷酸緩沖液中，用0.1mol/L氫氧化鈉（約0.5ml）調(diào)節(jié)到pH7.4，再加磷酸緩沖液至100ml，置冰箱內(nèi)保存，可穩(wěn)定2周?；|(zhì)中可加麝香草酚（每毫升基質(zhì)加入0.9g）防腐。置冰箱內(nèi)至少可保存1個(gè)月。分裝安瓶滅菌后，室溫至少可用3個(gè)月。血清ALT的測(cè)定1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液：稱(chēng)19.8mg2,4-二硝基苯肼，溶解于100ml1mol/L鹽酸中，置是室溫中保存。0.4mol/L氫氧化鈉溶液：將16.0g氫氧化鈉溶解于水中，并加至100ml，置具塞塑料試劑瓶中，室溫可長(zhǎng)期保存。2mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取22.0mg丙酮酸（AR），置于1000ml容量瓶中，加0.05mol/L硫酸至刻度。血清ALT的測(cè)定【操作方法】

在測(cè)定前，將基質(zhì)在37℃水浴箱內(nèi)預(yù)溫5min使用。具體操作按表1-1進(jìn)行。管號(hào)測(cè)定管對(duì)照管血清（ml）0.10.1基質(zhì)溶液（ml）0.5—表1-1ALT測(cè)定操作步驟血清ALT的測(cè)定

各管混勻后，在37℃水浴保溫20min，然后每管加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml，室溫放置10min，在505nm以蒸餾水校正零點(diǎn)，讀取各管的吸光度。測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得ALT活力單位。2,4-二硝基苯肼溶液（ml）0.50.5基質(zhì)溶液（ml）—0.5混勻后，在37℃水浴中保溫30min。血清ALT的測(cè)定【標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制】按表1-2向各管中加入相應(yīng)試劑。管號(hào)012340.1mol/L磷酸緩沖液（ml）0.100.100.100.100.102mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.050.100.150.20基質(zhì)緩沖液（ml）0.500.450.400.350.30相當(dāng)于酶活力（卡門(mén)氏單位）0285797150表1-2ALT各標(biāo)準(zhǔn)管的配制血清ALT的測(cè)定各管加入2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml，混勻，37℃20min后加入0.4mol/L氫氧化鈉溶液0.5ml。混勻，放置10min后在505nm比色，以蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，讀取各管吸光度。各管吸光度減去“0”號(hào)管吸光度，所得差值與對(duì)應(yīng)得卡門(mén)氏酶活力單位作圖?！九R床意義】很多臟器都含有ALT，其分布大致為肝＞腎＞心＞肌肉。肝內(nèi)ALT活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它臟器的活性，主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)的可溶性部分，測(cè)定ALT對(duì)反映肝臟損害具有特殊意義。血清ALT活性增高原因：急性病毒性肝炎；骨骼肌、腎臟及胰腺等組織壞死；伴有急性肝炎的傳染性單核細(xì)胞增多癥；嚴(yán)重心肌梗塞、心力衰竭時(shí)的肝郁血；膽道疾病、肝外癌性膽道梗阻性黃疸、膽石癥、膽管炎及膽囊炎；藥物、酒精、鉛、汞、四氯化碳等中毒；外科手術(shù)、麻醉、劇烈運(yùn)動(dòng)、早期妊娠等。血清ALT的測(cè)定血清ALT的測(cè)定【注意事項(xiàng)】溶血的血清可能會(huì)引起測(cè)定管吸光度增加，因此，檢測(cè)此類(lèi)標(biāo)本時(shí)，應(yīng)做血清標(biāo)本對(duì)照管。當(dāng)血清的標(biāo)本酶活性超過(guò)150卡門(mén)單位時(shí)，應(yīng)將血清用生理鹽水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。血清ALT的測(cè)定【注意事項(xiàng)】加入2,4-二硝基苯肼溶液后，應(yīng)充分反應(yīng)混勻，使反應(yīng)完全，加氫氧化鈉溶液方法要一致，不同方法會(huì)導(dǎo)致吸光度讀數(shù)的差異?；|(zhì)中的α-酮戊二酸和2,4-二硝基苯肼均為呈色物質(zhì)，稱(chēng)量必須準(zhǔn)確，每批試劑的空白管吸光度上下波動(dòng)不用超過(guò)0.015，如超出此范圍應(yīng)檢查試劑及儀器方面等問(wèn)題。血清AST的測(cè)定血清中門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）作用于天門(mén)冬氨酸及α-酮戊二酸組成的基質(zhì)，產(chǎn)生草酸乙酸及谷氨酸。草酸乙酸脫羧基后最終產(chǎn)物也是丙酮酸?！驹怼垦錋ST的測(cè)定丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，再與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，計(jì)算出酶的單位。血清AST的測(cè)定【試劑】0.1mol/L磷酸緩沖液，PH7.01mmol/L2,4-二硝基苯肼4mol/L氫氧化鈉2mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液以上四種試劑與ALT比色法相同。血清AST的測(cè)定【試劑】AST基質(zhì)液（DL-門(mén)冬氨酸200mmol/L，α-酮戊二酸2mmol/L）：稱(chēng)取α-酮戊二酸29.2mg和DL-門(mén)冬氨酸2.66g，置于一小燒杯中，加入1mol/L氫氧化鈉約1.5ml，溶解，加0.1mol/L磷酸緩沖液約50ml，校正至pH7.4，然后將溶液移入100ml容量瓶中，用磷酸緩沖液稀釋至刻度，放置冰箱保存。血清AST的測(cè)定【操作方法】同ALT比色測(cè)定法，但酶反應(yīng)作用時(shí)間改為60min。血清AST的測(cè)定【標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制】標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制按表1-3向各管加入相應(yīng)試劑。表1-3AST各標(biāo)準(zhǔn)管的配制管號(hào)012340.1mol/L磷酸緩沖液（ml）0.100.100.100.100.10基質(zhì)液（ml）0.500.450.400.350.30丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.050.100.150.20相當(dāng)于丙酮酸試劑含量(umol)00.100.200.300.40相當(dāng)于酶活力（卡門(mén)氏單位）024