分光光度計和流式細胞儀介紹

吸光分光光度計

在光譜分析中，依據物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m,主要用于有機化合物結構鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結構鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質的定量分析。

紫外可見吸收光譜1．光的基本性質

光是一種電磁波，具有波粒二象性。光的波動性可用波長、頻率、光速c、波數（cm-1）等參數來描述：

=c

；波數=1/=/c

光是由光子流組成，光子的能量：

E=h=hc/

（Planck常數：h=6.626×10-34J×S)

光的波長越短（頻率越高），其能量越大。白光(太陽光)：由各種單色光組成的復合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm

遠紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）2.物質對光的選擇性吸收及吸收曲線M+熱M+熒光或磷光

E=E2-

E1=h

量子化；選擇性吸收;

分子結構的復雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；

M+

h

M*基態(tài)激發(fā)態(tài)E1

（△E）E2吸收曲線的討論：（1）不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax則不同。

（2）吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據之一。（3）不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據。光的吸收定律朗伯—比耳定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。A∝b

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。A∝c

二者的結合稱為朗伯—比耳定律朗伯—比耳定律數學表達式

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c’：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關系為：

a=ε/M

（M為摩爾質量）透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關系:

A

＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的依據。應用于各種光度法的吸收測量；流式細胞術的基本概念流式細胞術（FlowCytometry,簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術，同時可以對特定群體加以分選。散射光信號

當細胞顆粒通過聚集的激光束時，激光向各個方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號（FSC）。與激光束垂直的稱為側向角散射光信號（SSC）。散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC,SideScatter）

細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性前向角散射光信號側向角散射光信號外周全血細胞散射光雙參數點圖

（紅細胞溶解后）

顆粒雜質、氣泡對檢測的影響熒光信號