植物組織培養(yǎng)實(shí)用技術(shù)

植物組織培養(yǎng)實(shí)用技術(shù)花卉組織培養(yǎng)實(shí)用技術(shù)(以非洲菊為例)非洲菊組織培養(yǎng)技術(shù)非洲菊屬多年生草本花卉。重瓣花，花色有紅、橙紅、淡紅、白色，花色艷麗，可用作切花生產(chǎn)或盆栽觀賞。傳統(tǒng)的繁殖方法為播種或分株繁殖，但非洲菊種子壽命短、發(fā)芽率低，而且播種繁殖變異率很高，難以得到性狀一致的種苗，因而不能用于規(guī)模生產(chǎn)；而分株繁殖則存在繁殖慢，易退化和傳播病害，也不適于現(xiàn)代的大規(guī)模生產(chǎn)，因而目前國(guó)外一般都采用組織培養(yǎng)的方法來(lái)生產(chǎn)種苗。一．外植體的選擇

1、文獻(xiàn)資料綜述莖尖是一種較好的外植體，出愈率最高、繁殖速度快，但取材有限、滅菌很易產(chǎn)生藥害。幼葉、幼葉柄、花梗作為外植體，可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，但是誘導(dǎo)成苗難?；ㄍ惺欠侵蘧战M織培養(yǎng)中比較理想的外植體，其好處在于花托較大，易于剝?nèi)?，并有花被包裏，污染程度輕，易于消毒，污染率低首先要選擇花大、花色艷麗、市場(chǎng)流行的品種，然后再選擇無(wú)病蟲(chóng)害、植株生長(zhǎng)健壯、花色純正的優(yōu)良品種單株進(jìn)行取材。作為外植體的花蕾要選取直徑在1.0cm左右，而且未露心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能獲得滿意的效果。2外植體的選擇方法

二．外植體的消毒方法1

1、剝?nèi)ネ鈱虞嗥?，在自?lái)水下沖洗干凈

2、置0.15%的升汞溶液中浸泡12~15分鐘

3、取出后剝?nèi)ネ獠克休嗥?在1%的次氯酸鈉溶液中消毒10分鐘

4、放入無(wú)菌水中充分洗滌3次方法21、剝?nèi)ネ鈱虞嗥谧詠?lái)水下沖洗干凈

2、置70%酒精浸泡30秒

2、用0.1%升汞加數(shù)滴吐溫浸泡5～8分鐘

3、無(wú)菌水沖洗6～7次三．外植體的原代培養(yǎng)1、將滅菌后的花蕾外植體，剪成1.0cm長(zhǎng)的小段2、在超凈工作臺(tái)上用0.1%氯化汞（HgCl2）對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒6~8min，小心傾去氯化汞溶液3、用無(wú)菌水沖洗6~7次4、接種在MS+BA1㎎/L+IAA0.5mg/L誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基上四．試管苗的增殖與繼代培養(yǎng)培養(yǎng)6~7周以后，愈傷組織上陸續(xù)有小芽分化，此時(shí)將帶有小芽的愈傷組織切成2~4個(gè)小塊，分別移到MS+BA0.2～1㎎/L+NAA0.2mg/L﹢KT0.3mg/L誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基上。培養(yǎng)一段時(shí)間后，又有小芽陸續(xù)分化。培養(yǎng)4周后，把這些繼代培養(yǎng)的芽叢分割，并移到新鮮的培養(yǎng)基上。每次繼代培養(yǎng)時(shí)間約為4周，芽叢的發(fā)生力可保持半年左右。在每次繼代前，高于3cm的小苗轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基：1/2MS+BA1mg/L上，可促進(jìn)幼苗迅速長(zhǎng)大。注意1、在初級(jí)培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)時(shí)，降低MS中的氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致芽的發(fā)生率降低，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮之比為1：2時(shí)對(duì)非洲菊芽的增殖最好。2、隨BA濃度的提高，增殖速度相應(yīng)提高。但在較高的BA濃度條件下芽苗會(huì)變細(xì)、變?nèi)?，且隨BA濃度進(jìn)一步提高，芽苗變得更加叢生、細(xì)弱。3、生產(chǎn)中在努力提高芽苗增殖率的同時(shí)，還應(yīng)保證分生芽苗的健壯。根據(jù)品種不同,一般把增殖率控制在2.5-5.0之間。五．試管苗的壯苗與生根將長(zhǎng)高的無(wú)根苗(2～3㎝)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)根培養(yǎng)基：1/2MS+NAA0.1mg/L。7～8天后，小苗基部會(huì)長(zhǎng)出3～5條不定根，12～15天就可以出瓶，生根率達(dá)到95%以上。附加蔗糖30mg/l、瓊脂7g/L,pH6.0。培養(yǎng)溫度25~27℃，光照12～14小時(shí)，光照強(qiáng)度2000lx。在無(wú)糖的MS培養(yǎng)基上,植株生根快,且生根率高。無(wú)糖或低糖培養(yǎng)所生根系發(fā)達(dá)，呈白色，試管苗過(guò)渡成活率高。糖的濃度以0～1.5%為好,低鹽培養(yǎng)基生根效果較好。六．試管苗的移栽與田間管理欲移栽的組培苗先去掉瓶蓋通風(fēng)煉苗，3天后將生根苗洗凈根部附著物，移入溫室內(nèi)的珍珠巖+腐殖土（1：1）基質(zhì)中，繼續(xù)訓(xùn)化一周內(nèi)保持遮光80％和適當(dāng)?shù)臐穸?，濕度?0%～70%為宜，溫度15～25℃。一周后，適當(dāng)增加光照，且每周淋一次無(wú)機(jī)液肥。在2周內(nèi)保持較高的空氣相對(duì)濕度，3周時(shí)幼苗長(zhǎng)出白根，新葉抽出。一個(gè)月左右長(zhǎng)出4片新葉，株高6～8厘米，可大定植或上市出售，移栽成活率97%。草莓組織培養(yǎng)技術(shù)草莓屬多年生草本植物，植株矮小。草莓的莖呈短縮狀，地上短縮莖節(jié)間極短，節(jié)密集。地下短縮莖為多年生，可發(fā)育成不定根。葉屬于基生三出復(fù)葉，離生雄、雌蕊離生。果實(shí)為假果，主要是花托膨大肉質(zhì)化形成，瘦果以聚合果形式生于花托上。果實(shí)成熟時(shí)果肉紅色，粉紅色或白色。一、外植體的選擇選擇結(jié)果性優(yōu)良的草莓母株上新抽出的匍匐莖作外植體，以每年6～7月份最為適宜。在無(wú)病蟲(chóng)害的田塊，連續(xù)晴天3～4d時(shí)選取生長(zhǎng)健壯、新萌發(fā)且未著地的匍匐莖段3cm長(zhǎng)作外植體。二、外植體的消毒消毒步驟①用洗滌靈水溶液洗去材料表面的油質(zhì)②用70％的乙醇浸泡數(shù)秒以除去表面的蠟質(zhì)③用3％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15～30min，然后用無(wú)菌水沖洗3次把芽放在解剖鏡下，無(wú)菌條件下，用鑷子、刀片、解剖針等工具把芽外面的幼葉和葉原基除去，使生長(zhǎng)點(diǎn)暴露。用利刀切下含有1～2個(gè)葉原基，大小為０.5mm的生長(zhǎng)點(diǎn)。三、外植體的原代培養(yǎng)莖尖分離后，迅速接入MS+6BA０.5mg／L+IBA0.1mg／L原代培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為22～25℃，日照16～18h/d，光強(qiáng)3000Lx。注意在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠，所以較高的溫度和充足的光照時(shí)間必須保證。經(jīng)2～3個(gè)月的培養(yǎng)，可生長(zhǎng)分化出芽叢，一般每簇芽叢含20～30個(gè)小芽為適。四、試管苗的增殖與繼代培養(yǎng)把芽叢割成芽叢小塊，轉(zhuǎn)入MS+6－ＢＡ１mg／L培養(yǎng)基中，令其長(zhǎng)大，以利分株，待苗長(zhǎng)大到1～2cm時(shí)，可將叢芽分成有3～4個(gè)芽的小芽叢，再轉(zhuǎn)入前述的分化培養(yǎng)基中，又會(huì)重復(fù)上述過(guò)程，達(dá)到擴(kuò)大繁殖的目的。經(jīng)過(guò)3～4周的增殖培養(yǎng)可獲得由30～40個(gè)腋芽形成的芽叢及植株。五、試管苗的生根與練苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBAl.0mg／L，可使發(fā)根整齊，由于草莓地下部分生長(zhǎng)快，發(fā)根力較強(qiáng)，也可將具有兩片以上正常葉的新莖從試管中取出進(jìn)行試管外生根。健壯的生根苗，應(yīng)將芽叢切割開(kāi)，單個(gè)芽轉(zhuǎn)接到專門的生根培養(yǎng)基中生根，培養(yǎng)4周后，可長(zhǎng)成約4--5cm高并有5～6條根的健壯苗。溫度保持在23℃左右，光照度2000Lx，12h光照。試管苗馴化時(shí)，用鑷子把草莓苗從試管瓶中取出，洗掉根系附帶的瓊脂培養(yǎng)基。培養(yǎng)土以等量的腐殖土和河砂為好，用蒸汽消毒。在溫室內(nèi)馴化，栽前壓實(shí)，澆透水，用竹簽在缽中央打一小孔，將試管苗插入其中，壓實(shí)苗基部周圍基質(zhì)，栽后輕澆薄水，以利幼苗基部和基質(zhì)密合。以后每天葉面噴水3~4次，4~5d就成活，展開(kāi)新葉。當(dāng)檢查有一定的根系生出，可逐漸降低濕度和土壤含水量，進(jìn)入正常幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育管理階段。六、試管苗的移栽與田間管理為提高母株的繁殖株數(shù)可采用5mg/L赤霉素,每株5ml處理和摘蕾的方法。在5月上旬和6月上旬分兩次進(jìn)行。摘蕾可減輕母株的營(yíng)養(yǎng)負(fù)擔(dān)，促使匍匐莖的大量發(fā)生，田間地每一株可繁殖150～200株。母株必須保證每株有大于3.3m2的營(yíng)養(yǎng)面積。再是注意匍匐莖排列位置，不要交錯(cuò)重疊，不利采苗，采苗也要適時(shí)進(jìn)行。無(wú)論秋季或春季種植，繁殖床必須要進(jìn)行土壤消毒，小面積可用蒸氣劑料混合消毒，可防治草莓萎縮病、根腐病、萎凋病等的發(fā)生。

龍牙百合組織培養(yǎng)技術(shù)龍牙百合屬百合科、百合屬、百合種，藥食兼用，是上等的滋補(bǔ)佳品，栽培經(jīng)濟(jì)效益好。百合繁殖方法主要有分球繁殖、鱗心繁殖、鱗片繁殖等，但經(jīng)多代無(wú)性繁殖以后，導(dǎo)致病毒積累、種性退化，嚴(yán)重地制約著百合產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。利用組織培養(yǎng)與脫毒技術(shù)相結(jié)合，能夠迅速去除無(wú)性繁殖體內(nèi)病毒，復(fù)壯品種，并可加快百合的快速繁殖速度。龍牙百合特征:鱗莖，無(wú)皮，廣卵形，外部鱗片長(zhǎng),將整個(gè)鱗莖包裹，直徑5~15厘米，白色，莖高90厘米左右，直立莖上葉多而散生，披針形，葉色從濃綠，光滑?；▎紊o頂?；ǘ涑世葼铋L(zhǎng)筒形，白色，有清香。一、外植體的選擇龍牙百合的許多器官、組織都可作為外植體，如鱗片、花梗、葉片、莖尖、腋芽、花瓣、花托、花絲、花藥、胚、子房、根尖等，其中采用鱗片作外植體的較多。以鱗片為例，在選取外植體時(shí)，要選擇具備龍牙百合品種特征、無(wú)病蟲(chóng)害危害的種球。外部鱗片易污染要將其剝離，中部鱗片肉質(zhì)厚，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，易誘導(dǎo)小鱗莖，是最佳的外植體。內(nèi)部鱗片幼嫩，誘導(dǎo)率低，不易產(chǎn)生小鱗莖，故不宜采用。就季節(jié)性而言，以秋、冬季的鱗片分化成小鱗莖的能力最強(qiáng)，二、外植體的消毒由于龍牙百合鱗莖都生長(zhǎng)在土中，受土壤微生物的影響，所以一般都會(huì)有污染。為此外植體消毒要嚴(yán)加注意，鱗片先用流線形自來(lái)水沖洗12小時(shí)以上進(jìn)行預(yù)滅菌再用70%酒精消毒1min，用0.1%升汞消毒10min最后用無(wú)菌水沖洗4~6次，用無(wú)菌吸水紙吸干水分。三、外植體的原代培養(yǎng)在同一塊鱗片上，其中部被誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖的能力最強(qiáng)，誘導(dǎo)出的小鱗莖生長(zhǎng)速度也相對(duì)較快，而兩頭位置相對(duì)要差些，所以在進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，要取已消毒外植體的中部將其切成1~2cm2大小，背部朝下置于MS+NAA0.03mg/kg+瓊脂0.7%+蔗糖3%培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度控制在23±2℃，光照控制在300~500Lx進(jìn)行脫分化，之后溫度控制在25±2℃，每天10h小時(shí)1500Lx光照。在龍牙百合組織培養(yǎng)過(guò)程中，鱗片誘導(dǎo)產(chǎn)生小鱗莖的過(guò)程是比較緩慢的，一般為30天以上，在鱗片上分化出多個(gè)肉眼可見(jiàn)的針尖大小的小突起。40天左右發(fā)育成球狀的可見(jiàn)鱗片的小鱗莖。四、龍牙百合的繼代培養(yǎng)鱗莖原代培養(yǎng)形成再生芽繼代培養(yǎng)生根培養(yǎng)馴化移栽大田培植大田培植龍牙百合組織培養(yǎng)技術(shù)路線回顧原代培養(yǎng)形成愈傷組織四、試管苗的繼代培養(yǎng)1、龍牙百合繼代培養(yǎng)路線思考分離小鱗莖培養(yǎng)繼代目的：以盡可能少的時(shí)間獲取盡可能多的組織苗，通過(guò)生根、馴化、移栽、培植，為生產(chǎn)提供大量種苗怎樣短期獲取大量組培苗？愈傷組織培養(yǎng)→芽誘導(dǎo)再生小鱗片剝離培養(yǎng)小鱗莖增重較快，但增殖率較小，僅100~200%增殖率較高，有300%~500%，但小鱗莖增重慢。用增重培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)方法可解決增殖率最高，可達(dá)500%以上，短期內(nèi)可誘導(dǎo)出大量愈傷組織。通過(guò)芽誘導(dǎo)，用增重培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)方法可獲取大量組培苗剪取莖段培養(yǎng)不產(chǎn)生伸長(zhǎng)莖段，此法不宜采用3、繼代培養(yǎng)1）分離小鱗莖培養(yǎng)選擇直徑達(dá)到0.5cm大小的小鱗莖，用鑷子將其輕輕剝離，置于增殖培養(yǎng)基中。把原來(lái)的鱗片重新轉(zhuǎn)到新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)小鱗莖，小鱗莖還會(huì)在其他的部位產(chǎn)生，整個(gè)生長(zhǎng)周期可以延續(xù)5~6個(gè)月。小鱗莖繼代培養(yǎng)30天左右可增殖1~2倍。開(kāi)始是在鱗莖基部產(chǎn)生小鱗莖，40天左右小鱗莖長(zhǎng)大，形成叢鱗莖。小鱗莖慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此時(shí)可把叢芽切割繼續(xù)培養(yǎng)增殖。2）再生小鱗片剝離培養(yǎng)選擇直徑達(dá)到0.5cm大小的小鱗莖，將其小鱗片分離下來(lái)，不用切割，直接接種到分化培養(yǎng)基上。20d后，在小鱗片基部會(huì)出現(xiàn)3~5個(gè)小突起，以后發(fā)育成小鱗莖。多數(shù)次生小鱗莖會(huì)抽生細(xì)長(zhǎng)葉片，造成小鱗莖不飽滿；不抽生葉片的小鱗莖相對(duì)要肥厚一些。如此反復(fù)進(jìn)行,可以使繁殖中間體得到快速增殖,但不可超過(guò)6代以上,否則分化率下降，小鱗莖細(xì)弱。4、增重培養(yǎng)直徑達(dá)到1cm以上即可進(jìn)行生根培養(yǎng)，對(duì)于達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)的小鱗莖，接種到增重培養(yǎng)基中，在此種培養(yǎng)基上，小鱗莖較少長(zhǎng)葉而明顯增重。如果能采用液體振蕩培養(yǎng)，則增重效果更佳。一般轉(zhuǎn)速設(shè)為110r/min。是否可以進(jìn)行淺層液體靜置培養(yǎng)，尚需試驗(yàn)。五、試管苗的生根與練苗將叢生的試管芽切成單株，接種在1/2MS+IBA0.5mg/L+活性炭0.5%生根培養(yǎng)基上，7天后芽基部開(kāi)始形成根尖。慢慢伸長(zhǎng)成輻射狀白色的小根。20天后根長(zhǎng)達(dá)7~10cm，基部稍膨大。溫度設(shè)置為25~28℃，光照強(qiáng)度為1500Lx．每天給予10~12h光照。當(dāng)試管苗長(zhǎng)成具4~5片葉，3~4條根，7cm左右高時(shí)，在自然光照和溫度條件下煉20d可移栽。六、試管苗的移栽與田間管理移栽時(shí)將試管苗根部的培養(yǎng)基洗干凈再移栽。龍牙百合試管苗比較嬌嫩，移栽幼苗最好用消毒的腐殖土或草炭+蛭石(2:1)的基質(zhì)中，育苗盤必須清洗消毒。水分管理百合鱗莖由許多肥厚的鱗片組成，鱗片內(nèi)貯存有許多水分和養(yǎng)分。一般來(lái)說(shuō)，百合是比較耐旱的。但百合有眾多柔嫩多汁的莖葉，需要由充足的水分來(lái)支撐。因此，在百合正常生長(zhǎng)過(guò)程中，需要比較充足的水分，才能保證莖葉的生長(zhǎng)和花蕾的發(fā)育。如果栽植后澆水不透或土壤濕度過(guò)大或棚內(nèi)濕度過(guò)高，對(duì)生長(zhǎng)不利，易出現(xiàn)徒長(zhǎng)，莖葉軟弱。在棚室栽培中如土壤干旱，應(yīng)在晴天上午澆水，增加棚室內(nèi)的濕度。切忌在中午日照強(qiáng)烈、氣溫很高時(shí)澆水或噴水，否則易引起百合芽枯病等生理性病害的發(fā)生。施肥管理百合的根系十分發(fā)達(dá)，吸收水分和養(yǎng)分的能力很強(qiáng)，生長(zhǎng)期間給予一定數(shù)量的氮、磷、鉀肥（比例為5：10：5）外，還需補(bǔ)充鈣、鎂、硫等肥料以及鐵、硼、錳、銅、鋅、銅等微量元素。百合無(wú)論在莖葉生長(zhǎng)期、現(xiàn)蕾開(kāi)花期和地下鱗莖膨大期，都需要足夠的營(yíng)養(yǎng)。在百合莖葉生長(zhǎng)期，可施用2-3次稀釋的餅肥液。硝態(tài)氮肥不易