第三章病毒感染力的滴定2013

第三章病毒感染力的滴定半數(shù)致死量LD50（50%lethaldose）半數(shù)感染量ID50(50%infectivedose)半數(shù)雞胚致死量ELD50(egg50%lethaldose)半數(shù)雞胚感染量EID50(egg50%infectivedose)半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量TCID50（tissueculture50%infectivedose)蝕斑形成單位（plaqueformingunit，PFU）測定病毒感染力的方法:將病毒作一定梯度的連續(xù)稀釋后接種于實驗動物或雞胚或培養(yǎng)細胞，每一稀釋度作多個重復(fù)，在一定時間內(nèi)，記錄動物（雞胚）發(fā)病或死亡的數(shù)量或細胞病變的情況，利用Reed-Muench法或Karber法計算病毒的感染力。測定病毒感染力的基本過程:一、病毒TCID50的測定操作步驟在青霉素瓶中將病毒作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1-10-10。將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度作8孔，每孔接種100μl。在每孔加入細胞懸液100μl，使細胞量達到3×105個/ml。設(shè)正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。結(jié)果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法10-110-210-310-410-510-610-710-8TCID50的計算方法（CalculationofTCID50）病毒液出現(xiàn)無CPE累計出現(xiàn)CPE孔稀釋度

CPE孔數(shù)孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)所占的%10-180510100（51/51）

10-280430100（43/43）

10-380350100（35/35）

10-480270100（27/27）

10-580190100（19/19）

10-67111191.7（11/12）

10-7354640（4/10）

10-8171137.1（1/14）

1、Reed-Muench法CPE：Cytopathiceffect距離比例＝（高于50%病變率的百分數(shù)-50%）/（高于50%病變率的百分數(shù)-低于50%病變率的百分數(shù)）＝（91.7-50）/（91.7-40）＝0.8lgTCID50=距離此例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)

=0.8×(-1)+(-6)=-6.8TCID50=10-6.8／0.1ml含義：將該病毒稀釋106.8倍接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl，可使50%接種孔的細胞發(fā)生病變。

2、Karber法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率

10-188/8=110-288/8=110-38

8/8=110-488/8=110-58

8/8=110-67

7/8=0.87510-73

3/8=0.37510-811/8=0.125lgTCID50=L-d(s-0.5)L：最高濃度的稀釋度的對數(shù)D：稀釋度對數(shù)之間的差S：陽性孔比率總和lgTCID50=-1-1×(6.375-0.5)=-6.875TCID50=10-6.875/0.1ml二、病毒蝕（噬）斑技術(shù)病毒蝕斑（plaque)

又稱空斑，指病毒在已長成的單層細胞上形成的局限性病灶。原理：適當稀釋的病毒懸液接種已經(jīng)長成單層的敏感細胞后，在覆蓋的固體或半固體介質(zhì)（瓊脂糖、甲基纖維素）的作用下，病毒在最初感染的細胞內(nèi)增殖后，只能進而感染并破壞臨近的細胞，經(jīng)過幾個增殖周期后，形成一個局限性的肉眼可見的病變細胞區(qū)，即局限性的病灶。plaquesProcedures操作步驟將敏感細胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。（一）用瓊脂糖覆蓋，中性紅染色將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。取1.6%-2%的低熔點瓊脂糖，融化后降溫至38-42℃，與等量預(yù)熱至38-42℃含6%-10%犢牛血清的無酚紅DMEM混合，注入細胞培養(yǎng)板中。室溫放置直至瓊脂糖凝固，或于4℃冰箱放置幾分鐘至瓊脂糖凝固，然后于37℃5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天于顯微鏡下觀察細胞病變情況。出現(xiàn)空斑后（2-3天），用含鈣、鎂的PBS將0.1%的中性紅貯存液10倍稀釋后滴加到細胞培養(yǎng)板上。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中作用1h，吸棄染液，繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)2-3h。TK-突變株與野毒形成的空斑的比較（二）用甲基纖維素覆蓋，結(jié)晶紫染色將敏感細胞在平皿或6孔板內(nèi)培養(yǎng)成單層。吸棄培養(yǎng)液，加入含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗1-2次。用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，選擇適當稀釋度的病毒懸液接種培養(yǎng)孔內(nèi)的單層細胞，接種量約為原培養(yǎng)液的1/10-1/5，以覆蓋住細胞單層為宜，每個稀釋度接種2-3孔。將培養(yǎng)板置37℃5%CO2培養(yǎng)箱吸附1h，吸棄病毒液，用含鈣、鎂的PBS（pH7.4）洗3次。覆蓋配好的4%羧甲基纖維素鈉（含3%新生牛血清）。48-72h后，待細胞出現(xiàn)病變或蝕斑時，各孔補滿10%中性甲醛，固定4h以上。棄掉孔中液體，流水側(cè)板沖洗數(shù)次。各孔補加配好的結(jié)晶紫溶液（0.35%、w/v），作用15min。棄掉染液，繼續(xù)沖洗數(shù)次，在37℃溫箱中敞口烘干，顯微鏡下計空斑數(shù)。蝕斑技術(shù)的應(yīng)用：用于病毒純化：挑選病毒的克隆株測定病毒懸液中感染病毒的含量如果是作病毒純化

挑取空斑于200μL維持液中，反復(fù)凍融3次，接種于PK-15細胞已長成單層的24孔細胞培養(yǎng)板，再于37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至完全發(fā)生病變。一般的毒種純化：收集病變的細胞懸液，通過PCR或其它方法進行鑒定，并測定TCID50，然后選TCID