流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析教學(xué)課件

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)技巧及數(shù)據(jù)分析

2021/4/171BD公司不同型號(hào)流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCanto2021/4/172一流式細(xì)胞儀的基本原理

*穩(wěn)定流動(dòng)

*激發(fā)光斑

*熒光補(bǔ)償

*熒光素選擇二數(shù)據(jù)分析及開(kāi)窗2021/4/173FCM原理示意圖2021/4/174

層流是液體穩(wěn)定流動(dòng)的必要條件,管道中層流的形成要滿足雷諾數(shù)

dρVRe=<2300，

η式中ρ、η分別為液體的密度和粘滯系數(shù)，d和V分別為管道的直徑和液體的平均流速。FCM利用層流技術(shù),使細(xì)胞流動(dòng)穩(wěn)定,并具有自聚焦作用,為細(xì)胞分析分選提供技術(shù)保證.

層流技術(shù)2021/4/175液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（示意圖）

流速與壓力的關(guān)系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

2021/4/1762021/4/177

低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

2021/4/178激發(fā)光源與光束成形系統(tǒng)2021/4/179.20um64um32um032um聚焦距離激光束聚焦透鏡強(qiáng)度光束成形與細(xì)胞受照方式這種橢圓形光斑的檢測(cè)區(qū)保證每個(gè)細(xì)胞分別受到光照且受檢時(shí)受到一致的光照

FCM的單細(xì)胞照明技術(shù)2021/4/17109、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/32023/2/32023/2/315、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。。二月232023/2/32023/2/32023/2/32/3/202316、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2023/2/32023/2/303February202317、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32021/4/1712熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

2021/4/1713UncompensatedvsCompensatedFL1FL2

利用電子技術(shù)或計(jì)算機(jī)軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號(hào)加以扣除的方法稱“熒光補(bǔ)償”熒光補(bǔ)償2021/4/1714熒光補(bǔ)償2021/4/1715Mean值判斷補(bǔ)償2021/4/1716雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615

紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+PeCy5+APC488525、575綠色、橙色

633670

紅色

熒光染料激發(fā)波長(zhǎng)（nm)發(fā)射波長(zhǎng)（nm)顏色2021/4/1717

用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長(zhǎng)的染料結(jié)合在一起，在488nm波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)。LaserCY7755PEECD620CY5670488nm能量傳遞染料：2021/4/1718流式細(xì)胞術(shù)操作流程：培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液制備熒光抗體標(biāo)記上機(jī)檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選繼續(xù)培養(yǎng)FISHPCR統(tǒng)計(jì)學(xué)分析2021/4/1719單分散細(xì)胞2021/4/1720FSCFSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞的大小和活力相關(guān)2021/4/1721SSCSSC信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)顆粒多少相關(guān)2021/4/1722細(xì)胞散色光信號(hào)2021/4/1723細(xì)胞熒光測(cè)量細(xì)胞的自發(fā)熒光

未經(jīng)染色的樣品細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到有微弱的熒光信號(hào).細(xì)胞的特異性熒光

經(jīng)過(guò)各種特異染色的細(xì)胞在激發(fā)光的照射下可測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào).2021/4/1724自發(fā)熒光信號(hào)與特異染色的熒光信號(hào)分析圖自發(fā)熒光信號(hào)2021/4/1725特異染色的熒光信號(hào)2021/4/1726DNA分析比較2021/4/1727排除雙聯(lián)體細(xì)胞2021/4/1728細(xì)胞阻滯在G2M期2021/4/1729雙克隆細(xì)胞周期分析2021/4/1730

溴脫氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine，

BrdUrd)是胸苷的一種類似物。它可以替代胸腺嘧啶摻入到細(xì)胞新合成的DNA分子中，成為S期細(xì)胞的一種標(biāo)記物。流式細(xì)胞術(shù)采用抗BrdUrd單克隆抗體免疫熒光和PI雙參數(shù)檢測(cè)細(xì)胞，不僅可檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和DNA含量，同時(shí)可以了解不同細(xì)胞的DNA合成能力高低。

BrdUrd和DNA雙標(biāo)記染色2021/4/17312021/4/1732BrdUrd與PI檢測(cè)2021/4/1733BrdUrd與PI檢測(cè)2021/4/1734BrdUrd與PI檢測(cè)2021/4/1735細(xì)胞三色熒光檢測(cè)2021/4/1736細(xì)胞因子測(cè)定*檢測(cè)T細(xì)胞(CD69)活化2021/4/1737G6=R1*R52021/4/1738*CD4抗原分子結(jié)構(gòu)引起CD4熒光強(qiáng)度下調(diào)2021/4/1739細(xì)胞因子分析圖*過(guò)敏性鼻息肉與鼻息肉細(xì)胞因子比較2021/4/1740純化單核細(xì)胞2021/4/1741調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)2021/4/17422021/4/1743G3=R1*R3G4=R1*R42021/4/1744凋亡細(xì)胞測(cè)定2021/4/1745凋亡細(xì)胞測(cè)定2021/4/1746細(xì)胞凋亡檢測(cè)2021/4/1747陰性的設(shè)置2021/4/1748血小板檢測(cè)2021/4/1749血小板檢測(cè)2021/4/1750血小板檢測(cè)2021/4/1751血小板檢測(cè)2021/4/1752謝謝2021/4/17539、人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2023/2/32023/2/3Friday,February3,202310、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2023/2/32023/2/32023/2/32/3/20234:41:21PM11、人總是珍惜為得到。2023/2/32023/2/32023/2/3Feb-2303-Feb-2312、人亂于心，不寬余請(qǐng)。2023/2/32023/2/32023/2/3Friday,February3,202313、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。2023/2/32023/2/32023/2/32023/2/32/3/202314、抱最大的希望，作最大的努力。03二月20232023/2/320