乙型病毒性肝炎的實(shí)驗(yàn)室檢查講座

我國HBV感染概況一般人群HBsAg攜帶率高達(dá)7.18%；現(xiàn)有慢性HBV感染者約9300萬人，占全世界的1/4；其中慢性乙型病毒性肝炎患者超過

2000萬例，占全世界慢性乙肝患者的1/3；15歲以下兒童HBsAg攜帶率下降顯著，1-4歲組僅為0.96%；1~4歲組HBsAb陽性率由1992年15.75%升至72.25%;抗HBcAb陽性率由1992年30.08%降至3.76%；12021/8/121HBV基因組HBVDNA是由長鏈L(負(fù)鏈)

和短鏈S(正鏈)

組成的不完全雙鏈環(huán)狀DNA，短鏈的長度相當(dāng)于長鏈的50%～85%。HBVDNA長鏈載有病毒蛋白質(zhì)的全部密碼，有4個(gè)開放讀碼框架(ORF)，分別稱為S、C、P和X區(qū)。編碼7個(gè)蛋白質(zhì)。HBVDNA易發(fā)生變異，特別是前S或S區(qū)基因較易突變。嗜肝DNA病毒的共同特點(diǎn)：內(nèi)含3~3.3kb松散環(huán)狀、部分雙鏈DNA基因組及DNA聚合酶；病毒的復(fù)制需逆轉(zhuǎn)錄過程。32021/8/122HBV抗原和抗體系統(tǒng)表面抗原(HBsAg)：HBV外膜糖蛋白=S+L+M蛋白

S蛋白：狹義的HBsAg指S蛋白。HBsAg陽性說明機(jī)體有HBV感染。中分子蛋白：preS2+S

大分子蛋白：preS1+preS2+SS蛋白中分子蛋白大分子蛋白PreS1PreS2S1.HBsAg和抗-HBs2021/8/123e抗原(HBeAg)：是可溶性蛋白質(zhì)只存在于血液中是病毒復(fù)制和傳染性的標(biāo)志e抗體(抗-HBe)：對(duì)HBV感染有一定的保護(hù)作用其出現(xiàn)標(biāo)志著病毒復(fù)制減少、傳染性降低前C區(qū)C區(qū)前C/C蛋白HBeAgHBcAg表達(dá)切割、加工HBeAg只存在于血清中HBVC基因分泌到細(xì)胞外2.HBeAg和抗-HBe52021/8/124HBV的三種形態(tài)1,HepatitisBvirion(Daneparticle)2,secretedfilament3,secretedsphere62021/8/1256HBV自然復(fù)制周期2021/8/1267生物化學(xué)檢測1HBV血清標(biāo)志物的檢測2HBV分子生物學(xué)診斷3HBV臨床藥物療效檢測4HBV感染的實(shí)驗(yàn)室檢查2021/8/1271.乙型肝炎的生物化學(xué)檢測主要指標(biāo)：ALT,AST,ASTm，血清白蛋白，血清膽紅素，膽堿酯酶,甲胎蛋白,凝血酶原時(shí)間(PT)及部分凝血因子；82021/8/128方法學(xué)的發(fā)展ELISA：靈敏性高，成本低，適用于普通病人篩查；膠體金免疫層析法(金標(biāo)法)：簡便易行，可用于急診病人快速檢測；化學(xué)發(fā)光法定量檢測：價(jià)格昂貴，可用于HBVMs為臨界值的病人的確證；可間接反映宿主HBV的復(fù)制水平，在評(píng)價(jià)抗病毒治療的病毒學(xué)應(yīng)答、療效和判斷預(yù)后方面有重要意義。新增檢測指標(biāo)Pre–S1、Pre–S2及其相應(yīng)抗體對(duì)乙肝兩對(duì)半的新認(rèn)識(shí)92.HBV血清標(biāo)志物檢測2021/8/12910HBV血清標(biāo)志物檢測方法的成本效果分析(1)2021/8/121011HBV血清標(biāo)志物檢測方法的成本效果分析(2)Back2021/8/121112Terminal

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Transcriptase

(RT)RNaseHrt1rt344preS1preS2Ss1s266HBsAg2021/8/1212XMutationofS&Pre-SS基因“a”決定簇

G145R

變異，與抗-HBs的親和力降低S基因變異可導(dǎo)致隱匿性HBV感染(occultHBVinfection)，表現(xiàn)為血清HBsAg陰性，但仍可有HBV低水平復(fù)制(血清HBVDNA常<104拷貝/ml)獻(xiàn)血員人群，隱匿性HBV感染的檢出率可達(dá)0.19%142021/8/1213142021/8/121415Pre–S1檢測的臨床價(jià)值前S1蛋白主要存在于Dane顆粒和管型顆粒上，在HBV感染宿主細(xì)胞過程及在病毒復(fù)制和刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)中起重要作用;前S1抗原與HBeAg之間有高度相關(guān)性，并可區(qū)別因變異種及其他原因造成的乙肝病毒e抗原(HBeAg)假陰性，可作為HBeAg假陰性補(bǔ)充，從而準(zhǔn)確反映患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況；可作為HBV感染及復(fù)制的標(biāo)注，與其它血清標(biāo)志物聯(lián)合檢測，相互補(bǔ)充。Back2021/8/121516大三陽小三陽vs2021/8/1216HBV血清學(xué)標(biāo)志檢測結(jié)果分析162021/8/121718類型HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAb樣本數(shù)(n)構(gòu)成比(%)1＋－－－＋40.212＋－＋－＋231.203＋－－＋＋985.114－－－－＋462.405－－－＋＋683.556－＋－＋＋1849.607－＋－－＋633.298－＋－－－47024.539－－－－－96050.10合計(jì)1257172335048619161001916例HBV血清標(biāo)志物陽性類型分布模式2021/8/1218192021/8/1219202021/8/122021HBVDNA定量檢測病毒復(fù)制水平最可靠，最直接的證據(jù)，與傳染性和疾病進(jìn)展密切相關(guān)；主要用于HBV感染的判斷，治療適應(yīng)癥的選擇及抗病毒療效的判斷。HBV基因分型基因分型的必要性；基因分型的主要方法；HBV耐藥突變的檢測3.HBV分子生物學(xué)診斷2021/8/1221慢性HBV感染治療適應(yīng)癥的選擇HBeAg陽性，HBVDNA載量>105copies/ml,ALT>2×ULN;HBeAg陰性，HBVDNA載量>104copies/ml,ALT>2×ULN;HBVDNA持續(xù)陽性，年齡>40歲，ALT大于正常上限，也可給予抗病毒治療；HBVDNA持續(xù)陽性，年齡>40歲，ALT持續(xù)正常，應(yīng)密切隨訪，動(dòng)態(tài)觀察疾病進(jìn)展，必要時(shí)行肝組織檢測，有病變證據(jù)時(shí)，可以給予抗病毒治療；222021/8/1222HBV感染抗病毒治療的療效評(píng)估治療終點(diǎn)：HBVDNA明顯下降或低于檢測下限，并伴有ALT正常；HBVDNA水平治療開始后3個(gè)月內(nèi)持續(xù)下降1log以上才說明治療有效；每日0.5mg恩替卡韋治療1年時(shí),HBeAg陽性和陰性慢性乙型肝炎患者HBVDNA檢測不到率分別為67%和90%,恩替卡韋的HBeAg轉(zhuǎn)換率為21%,與其他口服抗病毒藥相似。并不以HBeAg轉(zhuǎn)陰或HBsAg轉(zhuǎn)陰為治療終點(diǎn)或目標(biāo)。232021/8/1223HBVDNA定量檢測試劑盒的性能對(duì)比242021/8/122425同時(shí)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV,HIV-1,衣原體，及淋病的一體化檢測Back2021/8/1225病毒基因突變疾病進(jìn)展臨床表現(xiàn)對(duì)干擾素應(yīng)答耐藥變異生化學(xué)改善HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換HBVDNA清除急性乙型肝炎慢性乙型肝炎肝硬化(LC)肝細(xì)胞癌(HCC)26HBV基因型/基因亞型2021/8/1226分型方法優(yōu)缺點(diǎn)序列測定法最直接，最可信，是HBV基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但繁瑣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，混合型檢測能力差，不適于大樣本檢測。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)較測序法簡便，適于大樣本檢測，但由于需要進(jìn)行酶切，所以操作仍較為繁瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問題。pre-S2單克隆抗體酶聯(lián)免疫測定(mAbsEIA法)簡單、快速，已商品化，適于大樣本檢測，但檢測費(fèi)用較高并不能有效鑒別有些混合型感染和HBsAg低表達(dá)及某些表位表達(dá)不充分的標(biāo)本。分子探針雜交法簡單、快速，對(duì)混合型檢測非常敏感，已商品化，適于大樣本檢測，但檢測費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度還有待提高。型特異性引物PCR法簡單、快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測。但特異度還有待提高。常用HBV基因分型方法比較272021/8/1227B型特異性“引物對(duì)”的特異度分析B型特異性引物HB（正義鏈）：5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’28Back2021/8/12284.HBV臨床藥物治療監(jiān)測乙肝病毒的耐藥性檢測，是精準(zhǔn)治療乙肝的關(guān)鍵！！目前由于治療不夠規(guī)范，造成我國目前超過95%的乙肝患者發(fā)生耐藥、病毒變異、病毒耐藥，變異檢測勢在必行！拉米夫定是第一個(gè)被批準(zhǔn)治療慢性乙型肝炎的口服抗病毒藥,已在全世界廣泛應(yīng)用。但其耐藥發(fā)生率高,治療1年時(shí)耐藥發(fā)生率為23%,2年為46%,3年為55%,4和5年分別為65%和71%。292021/8/1229耐藥---核苷(酸)類似物(NA)治療失敗最重要原因30拉米夫定LMV阿德福韋酯ADV替比夫定LdT恩替卡韋ETVHBV替諾福韋TDVNAs：抑制病毒復(fù)制長期使用耐藥變異2021/8/1230臨床耐藥表型耐藥基因耐藥耐藥研究312021/8/1231322021/8/123233PolymeraseTerminal

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(RT)RNaseHrt1rt344逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)某些位點(diǎn)變異與耐藥相關(guān)preS1preS2HBsAgs1s266可同時(shí)分析：耐藥變異，HBsAg變異，基因型，血清型2021/8/1233全長RT區(qū)分析技術(shù)路線HBVDNA提取snPCR擴(kuò)增RT區(qū)PCR產(chǎn)物直接測序生物信息學(xué)