熒光分析法(2010)課件

《儀器分析實(shí)驗(yàn)》實(shí)驗(yàn)5熒光光度法測定維生素B2含量一、分子熒光分析法簡介(對光的吸收)發(fā)生激發(fā)態(tài)反應(yīng)分子內(nèi)的激發(fā)和衰變過程1.1熒光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)能量的躍遷與轉(zhuǎn)化的形式和速率：A1,A2吸收:10-15sVR振動(dòng)松弛：10-12sic內(nèi)轉(zhuǎn)化：10-11sisc系間竄越：

10-6

~10-2sF熒光：10-9~10-6sP磷光：10-6~100s激發(fā)光譜發(fā)射光譜1.2熒光光譜

任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜(Excitation)和發(fā)射光(Emission)譜。組成、結(jié)構(gòu)與衍化信息☆物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)☆環(huán)境與介質(zhì)條件☆與其它溶質(zhì)的相互作用☆反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

任何熒光化合物，都具有兩種特征的光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長發(fā)射光譜：固定激發(fā)波長掃描發(fā)射波長激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)em=620nm(MAX)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)ex=290nm(MAX)1.3熒光定量IF----熒光強(qiáng)度F-----熒光量子產(chǎn)率（☆注意：在一定濃度范圍內(nèi)適用）b--吸收光程--摩爾吸光系數(shù)C--熒光物質(zhì)濃度εIF=2.30kφFI0εbcIF=KC?問題：1）影響相對熒光強(qiáng)度的因素有哪些？2）試比較熒光法與紫外-可見分光光度法的分析性能。1.4熒光儀的基本構(gòu)造？問題：熒光光度計(jì)與紫外-可見分光光度計(jì)在光路設(shè)置上有什么不同？為什么？光源1.光源的要求：發(fā)射強(qiáng)度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強(qiáng)度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型：

氙燈光源高壓汞光源波長范圍：200~1000nm工作壓力：5~20atm啟動(dòng)電壓：20~40KV使用壽命：1000~2000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源：發(fā)射波長范圍寬發(fā)射光強(qiáng)度大單色器平面衍射光柵檢測器光電倍增管放大倍數(shù)：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池一樣2.吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池兩面透光熒光分光光度計(jì)的樣品池四面透光波長范圍3.使用注意事項(xiàng)容易破碎問題：紫外-可見分光光度計(jì)的吸收池與熒光分光光度計(jì)的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題紫外-可見分光光度計(jì):光源樣品池單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制熒光(磷光)分光光度計(jì):光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器紫外-可見分光光度計(jì)

測量池(吸收池)熒光分光光度計(jì)樣品池I0ItI0ItIF,p1.5分子熒光分析法的應(yīng)用簡介★常規(guī)分析應(yīng)用：

☆定性分析：φf；λex；λem；峰形等☆定量檢測：F=K﹒I0﹒φf﹒C☆其它（略）★高端生化研究：

☆分子相互作用研究；☆代謝動(dòng)力學(xué)跟蹤；☆顯微成像（物理遷移與化學(xué)衍化的原位“顯跡”）維生素B2含量的熒光光度法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線法將已知量的標(biāo)準(zhǔn)物經(jīng)過和樣品同樣處理后，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對熒光物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定樣品溶液的熒光強(qiáng)度后即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品溶液中熒光物質(zhì)的含量。熒光分析的靈敏度比紫外－可見分光光度法高103～104.FCsFxCx實(shí)驗(yàn)原理維生素B2的化學(xué)結(jié)構(gòu)C17H20N4O6★在近中性的水溶液中有較強(qiáng)的熒光發(fā)射:（535nm附近）

★在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定且熒光消失（pH=11）★易發(fā)生光降解，對熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)步驟１、試液配制：配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液取VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液(5ug/ml)1.00ml,2.00ml,3.00ml,4.00ml,5.00ml于25ml比色管中,稀釋至刻度.2、樣品藥片的處理及未知液的配制取2片藥片置于洗凈的小燒杯中,加20-30ml去離子水中,水浴中加熱30min,冷至室溫后,轉(zhuǎn)移到250ml容量瓶中,稀釋至刻度.過濾,棄取初濾液,取0.5ml到25ml比色管中,稀釋至刻度.3、VB2的熒光光譜的繪制掃描激發(fā)波長和發(fā)射波長,找出最大激發(fā)波長和發(fā)射波長.4、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作及樣品測定固定激發(fā)波長和發(fā)射波長,測定每管標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的熒光強(qiáng)度.2.3注意事項(xiàng)：☆試液的移取與稀釋☆系列標(biāo)液的測定順序☆即放即測，防光降解☆熒光儀的開關(guān)機(jī)順序2.4數(shù)據(jù)處理從熒光光譜圖上讀出最大激發(fā)（λex）和發(fā)射波長（λem）用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線法算出所配實(shí)測試液的濃度計(jì)算藥片中維生素B2的含量，并計(jì)算測定量占標(biāo)示量的百分?jǐn)?shù)日立F-2500型熒光光度計(jì)的使用“波長掃描”操作步驟

Start↓Methodsetting↓Samplename↓Pre-scan↓Measurement↓Dataprocessing↓Print↓EndMethod鍵的使用General→Measurement→WavelengthscanOperator→姓名(1)Instrument→Scanmode→Excitation(做激發(fā))Datamode→FluorescenceEMWL→523nmEXStartWL→300nmEXEndWL→500nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700V(2)Instrument→Scanmode→Emission(做發(fā)射)Datamode→FluorescencEXWL→354nmEMStartWL→360nmEMEndWL→700nmScanspeed→3000nm/minEXSlit→5.0nmEMSlit→5.0nmPMTVoltage→700VSamples→輸入樣品數(shù)→Updata→okPre-scan→按Pre-scan鍵Measurement→按Measurement鍵→Yes→okDataprocessing→顯示最大強(qiáng)度值Print→打印波長掃描圖↓“定量分析”操作步驟Method鍵的使用Start↓Methodsetting↓Samplename↓Measurement↓Print↓EndGeneral→saveas→存放文件地址Measurement→PhotometryOperator→姓名Quantitation→Quantitationtype→WavelengthCalibrationtype→1storderInstrument→Datamode→fluorescenceWavelengthmode→BothWLFixed

EX→370nmEM→523nmEX