實(shí)驗(yàn)一 酶的提取

實(shí)驗(yàn)一酶的提取及活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰柑崛〉囊话惴椒私獠煌蛩貙?duì)酶活力的影響掌握測(cè)定酶活力的方法實(shí)驗(yàn)原理多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機(jī)械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醍，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醍類物質(zhì)對(duì)微生物有毒害作用，所以傷口醍類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會(huì)提高。多酚氧化酶也可與細(xì)胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營(yíng)養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醍，鄰醍再相互聚合成醍或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)將采用蘋(píng)果為主要材料，通過(guò)組織細(xì)胞破碎勻漿、過(guò)濾、離心、有機(jī)溶劑沉淀等步驟獲得PPO的粗酶液，并對(duì)酶活力進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)步驟蘋(píng)果洗凈后，在4°c保溫，去皮取果肉200g，立即加入冷凍丙酮500ml，用高速組織搗碎機(jī)勻漿2min，用布氏漏斗抽濾，濾餅用200ml冷凍丙酮再次提取抽濾，白色粉末冷凍真空干燥，即得PPO丙酮粉。稱取丙酮粉0.5g，溶于250ml0.05M、pH6.8的預(yù)冷（4C）磷酸鹽緩沖液，用磁力攪拌器攪拌20min，5000rpm離心10min，上清液過(guò)濾，即得PPO粗酶液。酶活性測(cè)定：取酶液1ml，加入3ml反應(yīng)混合液（2.0ml0.1MpH6.5磷酸緩沖液、0.6ml1%鄰苯二酚溶液、0.4ml0.1%脯氨酸溶液），在37C恒溫水浴10min，立即加入6M尿素3ml終止反應(yīng)，4000rpm10min取上清液。在460nm處于1-2min內(nèi)測(cè)吸光值，空白對(duì)照中用緩沖液代替反應(yīng)液中的鄰苯二酚。計(jì)算以每克樣品每分鐘內(nèi)A460吸光值增加0.1為1U酶活力=A460*酶提取液總量（ml）/（0.1*反應(yīng)時(shí)間*樣品重量*測(cè)定用酶液量ml）（按齊瑩組的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算）思考題：除了用有機(jī)溶劑沉淀酶外，還可以用什么樣的方法沉淀酶？實(shí)驗(yàn)二酶提取液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)紫外分光光度計(jì)的使用方法掌握紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理和方法實(shí)驗(yàn)原理由于蛋白質(zhì)中存在含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，最大吸收峰在280nm處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的吸光度與其濃度成正比關(guān)系，可作定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，取四支試管，按表編號(hào)并加入試劑試劑管號(hào)1234lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）01.02.04.0蒸諧水（ml）43.02.00形或的蛋白質(zhì)濃度梯度（mg/ml）00.250.501.00A280加完后混勻，用紫外分光光度計(jì)測(cè)A280，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線取酶提取液1.0ml，加蒸餾水3ml，混勻，測(cè)A280nm，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白質(zhì)濃度。思考題本法與其他蛋白質(zhì)定量法相比，有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？實(shí)驗(yàn)三酶的固定化及固定化酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆彰腹潭ɑ椒ㄊ煜っ腹潭ɑ实暮饬恐笜?biāo)實(shí)驗(yàn)原理凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定性狀的固定化酶或固定化菌體。常用的凝膠有瓊脂、海藻酸鈣、明膠、聚丙烯酰胺等。本實(shí)驗(yàn)把脲酶用聚丙烯酰胺凝膠包埋起來(lái)制成固定化脲酶。固定化酶活力回收率是指固定化酶的活力與用于固定化的溶液酶的活力之百分比。固定化酶活力測(cè)定方法，有振蕩測(cè)定法、酶柱測(cè)定法和連續(xù)測(cè)定法等多種。常用的振蕩測(cè)定法，是將一定質(zhì)量的固定化酶，放在一定形狀、一定大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶最適反應(yīng)條件下，振蕩或攪拌反應(yīng)系統(tǒng)，反應(yīng)一定時(shí)間，取出一定量的反應(yīng)液，進(jìn)行活力測(cè)定。脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最適反應(yīng)pH7.0。氨與納氏試劑反應(yīng)生成黃色配合物，其吸光度與氨濃度成正比，可用于測(cè)定酶活力大小。實(shí)驗(yàn)用具（自己寫(xiě)）實(shí)驗(yàn)步驟稱取丙烯酰胺2.5g，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺0.5g，溶于30mlpH=7.0的磷酸鹽緩沖液中。取上述溶液10ml于燒杯中，冰水浴下加入100mg月尿酶，攪拌均勻，加入0.5ml10%過(guò)硫酸鉀溶液和0.5ml10%亞硫酸氫鈉溶液，待聚合反應(yīng)完成后，即得含酶凝膠。待凝膠充分固化后，切成2mm-3mm見(jiàn)方的小塊，反復(fù)水洗后，用干濾紙吸干水，稱重。將所得凝膠包埋尿酶重新稱重（m1）。取固定化尿酶0.3g，切碎。取兩支比色管（3號(hào)樣品管、1號(hào)空白管），分別稱取固定化酶100mg（m2）置于兩管中，各加蒸餾水9.0ml，磷酸緩沖液1.0ml，塞好管塞，于30°C保溫5min向3號(hào)管中加入30C預(yù)保溫的3%尿素溶液1.0ml，并準(zhǔn)確開(kāi)始計(jì)時(shí)，向1號(hào)管中加蒸餾水1.0ml，塞好管塞。在30C的恒溫水浴中反應(yīng)20min，并不斷振搖。酶反應(yīng)管反應(yīng)20min后準(zhǔn)時(shí)加入1.0ml1MH2SO4終止反應(yīng)，空白管同樣操作取3支干凈干燥試管編號(hào)（2號(hào)為標(biāo)準(zhǔn)氨溶液，1號(hào)、3號(hào)與上對(duì)應(yīng)）。3號(hào)管：吸取酶反應(yīng)液0.1ml，加蒸餾水4.40ml，納氏試劑0.5ml，搖勻。2號(hào)管：吸取空白反應(yīng)（1號(hào)）液0.1ml,加水4.30ml,加水0.1ml，納氏試劑0.5ml,搖勻。1號(hào)管：吸取1號(hào)管反應(yīng)液0.1ml,加入標(biāo)準(zhǔn)氨溶液0.1ml，納氏試劑0.5ml，搖勻。30min內(nèi)，在480nm波長(zhǎng)下比色測(cè)試吸光度，分別即為A1（空白）、A2（標(biāo)準(zhǔn)）和A3（樣品）。定義脲酶在30°C，中性條件下，每分鐘水解底物產(chǎn)生1umol氨的酶量為1U。溶液酶活力測(cè)定稱取脲酶100mg溶于10ml磷酸緩沖液中，加入3%尿素1ml，反應(yīng)后從中取出反應(yīng)液0.2ml，加入蒸餾水4.30ml，加入納氏試劑0.5ml，混勻在30Min內(nèi)測(cè)定吸光值。（也需要樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)管）計(jì)算100mg脲酶粉所得固定化酶的總活力（U1）U1=（A3-A1）*m1*V