遺傳與發(fā)育綜合實驗實驗講義

遺傳與發(fā)育

綜合實驗

講義

第一部分：分子標(biāo)記技術(shù)系列實驗：實驗一RAPD標(biāo)記

實驗內(nèi)容：1DNA制備

2PCR擴增3

RAPD結(jié)果檢測統(tǒng)計分析

實驗二SSR標(biāo)記實驗內(nèi)容：1基因組DNA制備2微衛(wèi)星DNA的擴增

3

SSR標(biāo)記檢測分析

實驗三AFLP標(biāo)記實驗內(nèi)容：1酶切與連接

2選擇性擴增3銀染

4目的DNA的回收第二部分植物基因克隆技術(shù)系列實驗實驗一利用RT-PCR技術(shù)分離目標(biāo)cDNA片段實驗內(nèi)容：1cDNA合成

2PCR擴增3篩選目標(biāo)cDNA實驗二mRNA差別顯示技術(shù)實驗內(nèi)容：1

RNA制備

2逆轉(zhuǎn)錄3PCR差異顯示mRNA

4.測序膠分離PCR產(chǎn)物

5.銀染6.結(jié)果與討論第一部分

分子標(biāo)記技術(shù)系列實驗遺傳標(biāo)記在遺傳學(xué)的建立和發(fā)展中有著舉足輕重的作用，同時也是作物遺傳育種的重要工具。遺傳標(biāo)記主要分為:形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記分子標(biāo)記。分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。DNA分子標(biāo)記具有能對各發(fā)育時期的個體、各個組織、器官甚至是細(xì)胞作檢測，既不受環(huán)境的影響，也不受基因表達(dá)與否的限制；數(shù)量豐富；遺傳穩(wěn)定；操作簡便等特點。廣泛應(yīng)用。

DNA分子標(biāo)記使得基因組作圖工作成了遺傳學(xué)上描述細(xì)胞中所含遺傳物質(zhì)的一個簡單概念，已形成了一門復(fù)雜的新興學(xué)科—基因組學(xué)，其影響之大不僅波及了生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)的各個方面，而且對社會也產(chǎn)生了巨大的沖擊。

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，其發(fā)音與英文字母“rapid”相同）技術(shù)是由美國杜邦公司的Williams和加里福尼亞生物研究所的Welsh于1990年同時發(fā)展起來的。核心技術(shù)都是通過PCR進行DNA擴增。

第一單元：RAPD標(biāo)記RAPD的基本原理：通過DNA擴增片段的多態(tài)性來檢測DNA所發(fā)生的遺傳變異。RAPD以檢測DNA的多態(tài)性為目的，但它檢查的不是限制性內(nèi)切酶片段的多態(tài)性，而是PCR擴增DNA片段的多態(tài)性，這種多態(tài)性反映了不同個體模板DNA的核苷酸變化。多態(tài)性產(chǎn)生的原因：一，模板中引物結(jié)合區(qū)的核苷酸變化導(dǎo)致擴增DNA片段多態(tài)性。

二，擴增范圍內(nèi)的堿基插入、缺失、DNA重排等核苷酸變化導(dǎo)致擴增DNA片段多態(tài)性。

1）取50-200mg新鮮葉片，置液氮中研磨成粉。2）將凍粉分配到兩個1.5或2.0ml的離心管中,加入提取緩沖液900μl,輕輕攪動,。3）各加入100μlSDS，于65℃水浴中保溫10-15min(間隔晃動2-3次)。實驗操作:1.DNA制備4）各加入160μl5mol/LKAc,充分混勻，冰浴中放置30min。5）

4℃下12000rpm離心15min。6）上清轉(zhuǎn)入新離心管中，加入等體積的氯仿/異戊醇，輕輕顛倒離心管數(shù)次，放置片刻。7）4℃下8000rpm離心10min。8）上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入2/3倍體積、-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻，放置30min,觀察DNA沉淀生成。9）

4℃下8000rpm離心10min，傾去上清液，將離心管倒置于吸水紙上，控干上清液。10）用80%的乙醇洗滌沉淀，吹干10-15min。11）加入100μlTE緩沖液充分溶解沉淀（若溶解不好，可置37℃水浴中保溫，促進溶解）。12）加入2μlRNase酶液，于37℃保溫1h。13）加入等體積的氯仿/異戊醇，混勻，放置幾分鐘后10000rpm5min,重復(fù)一次。14）轉(zhuǎn)移并量出上清液體積，置新離心管中，加入1/5倍體積的3mol/LNaAC,混勻，加入2.5倍體積的無水乙醇，輕緩混勻，室溫放置數(shù)分鐘。15）10000rpm離心5-10min，按9）操作，去盡上清液。16）用80%乙醇洗滌沉淀2-3次，吹干。加入10μlTE或dH2O溶解DNA，備用。1)在冰上做好針對不同DNA的100個PCR反應(yīng)混合液（加樣次序如下）：水1475μl10×緩沖液200μl10×dNTPS200μl引物(20μmol/L)20μlTag聚合酶5

μl終體積1900μl(分裝100管)DNA（10-100ng）每管1μl2．

PCR擴增：2)將反應(yīng)混合液等量分裝到反應(yīng)管中。3)加入DNA或引物4)蓋上小管，放到PCR儀上。5)進行PCR反應(yīng)，采用3步PCR程序：a)1個循環(huán)94℃4min36℃1min72℃1.5minb)45個循環(huán)94℃1min36℃1min72℃1.5minc)72℃5min4℃保存3．RAPD結(jié)果檢測：1）用1×TBE配2%瓊脂糖凝膠。2）PCR結(jié)束后，每個樣品中加入4μl凝膠上樣緩沖液。每個泳道上樣20μl，選擇合適的相對分子質(zhì)量Maker（如λHindIII/EcoRI）。3）

電泳。4）

觀察。第三單元：SSR標(biāo)記在人類及動植物的基因組中,包括內(nèi)含子、編碼區(qū)及染色體上的任一區(qū)域,均存在著由1～6個堿基對組成的簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeats),簡稱SSR,又稱之為微衛(wèi)星DNA(microsatellteDNA).研究表明,在真核生物中大約每隔10～50ｋｂ就存在1個微衛(wèi)星,其主要以2個核苷酸為重復(fù)單位,也有一些微衛(wèi)星重復(fù)單位為3個核苷酸,極少數(shù)為4個核苷酸或更多.

SSR較早應(yīng)用于人類和哺乳動物的研究,既可以作探針進行Southern分析,又可以根據(jù)其序列設(shè)計引物進行PCR檢測,是構(gòu)建遺傳連鎖圖譜非常有效的分子標(biāo)記。

另外,SSR標(biāo)記在物種的起源和進化、遺傳多樣性、遺傳疾病的診斷、基因表達(dá)等遺傳和育種有關(guān)的研究領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景.SSR標(biāo)記因具有:①隨機分布在整個基因組中;②多態(tài)性高;③可通過ＰＣＲ迅速測定,重復(fù)性好;④技術(shù)難度低,實驗成本較低;⑤引物序列公開發(fā)表,易在各實驗室中廣為傳播使用等特點。1．基因組DNA制備（略）。

注意：進行SSR分析時,要制備高分子量(HMW)的基因組DNA。SSR標(biāo)記雖然對DNA的質(zhì)量要求不是特別高,但要通過加入蛋白酶和RNA酶消化去除其中的蛋白質(zhì)和RNA,同時嚴(yán)格避免不同DNA之間的交叉污染.提取DNA后,測定濃度,并稀釋到10×10-9～20×10-9ｇ/μＬ(10～20ｎｇ/μＬ),-20℃貯存?zhèn)溆谩?．微衛(wèi)星DNA的擴增：反應(yīng)總體積為25μL

包括：10mmol/ＬTrisHClpH8.3,30mmol/LMg2+25mmol/LdNTP

0.4～10ｕDNA聚合酶2μmol/ＬSSR引物約100ｎｇ基因組DNAPCR擴增程序：94℃5min94℃30ｓ退火溫度30ｓ30cycle72℃1min72℃5min3．SSR標(biāo)記電泳檢測：分3個主要環(huán)節(jié)。1）電泳：

采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,設(shè)恒定功率,預(yù)電泳約30min后,加擴增樣品DNA4～6μL,電泳40～60min(視ＳＳＲ分子量大小及差異帶的可辨度調(diào)整電泳時間)。

2）染色：SSRPCR擴增產(chǎn)物電泳之后用銀染法來檢測擴增產(chǎn)物,不僅可避免使用同位素,而且分辨率很高,甚至能檢測出1ng以下的DNA。3）統(tǒng)計分析：觀察帶的有(計為1)或無(計為0)及相對位置,然后根據(jù)不同的研究目的,應(yīng)用相關(guān)軟件進行分析。第三單元：AFLP標(biāo)記AFLP（擴增片斷長度多態(tài)性

amplifiedfragmentlengmentpolymorphism）是一種十分有效的DNA指紋圖譜技術(shù)。1993年由Zabean和Vos提出完善。

AFLP不僅是RFLP和PCR相結(jié)合的一種技術(shù)，而且完善了RFLP和RAPD兩種方法的特長。

基本原理：對基因組DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增，使用雙鏈人工接頭與該酶切片段相連接作為擴增反應(yīng)的模板，在DNA聚合酶作用下進行PCR反應(yīng)。該技術(shù)的獨特之處在于人工設(shè)計合成了限制性內(nèi)切酶的通用接頭以及可與接頭序列配對的專用引物，因此在不需要事先知道DNA系列信息的前提下，就可對酶切片段性傳統(tǒng)的PCR擴增。

在檢測AFLP時，先用內(nèi)切酶酶解基因組DNA,再將接頭連接到限制性片段的兩端，然后用專用引物擴增連接后的限制性片段的混合物，擴增結(jié)果通過電泳顯示。

一般采用兩個限制性內(nèi)切酶，一個酶為多切點，另一個酶的切點較少，因而AFLP反應(yīng)過程中產(chǎn)生的主要是兩個酶共同酶切的片段。此外，設(shè)計的專用引物除了核心堿基系列和限制性內(nèi)切酶識別序列外，引物的3’段引伸出1-13個數(shù)量不等的隨機核苷酸堿基，通過運用不同數(shù)量的這種堿基，可以調(diào)節(jié)AFLP產(chǎn)物的條帶特異性和數(shù)量，從而提供較多的基因組多態(tài)性信息。

不同樣品由于DNA序列不同，擴增出片段數(shù)及長度各不相同，經(jīng)變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳就能區(qū)分出不同樣品的帶之間的差異，作為遺傳標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖，或由于其獨到的檢測DNA多態(tài)性的方式，已成為基因組研究的一個非常有用的工具，與RFLP相比，它無需了解DNA模板序列，產(chǎn)生的多態(tài)性較多，與RAPD相比，它的可重復(fù)性得到極大提高。

AFLP技術(shù)的應(yīng)用：從AFLP技術(shù)建立以來，在植物研究領(lǐng)域已被應(yīng)用于許多方面，如：生物多樣子性分析、建立基因圖譜、得當(dāng)與農(nóng)業(yè)性狀對應(yīng)的標(biāo)志、用于基因克隆等。作為分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)有以下要求：穩(wěn)定性好、分辨率高、多態(tài)性強、效率高。另外，AFLP的標(biāo)志還可以進一步用于系譜分類，通過各樣品共有標(biāo)志的多少，可以分出它們之間的遠(yuǎn)近。

AFLP最大的特點是能產(chǎn)生大量的DNA標(biāo)志，建立基因圖譜，通過對它的分析，人們可以了接導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)特點。到目前為止，已有幾十種植物得到了大量DNA標(biāo)志。包括：向日葵、棉花、油松、胡椒、小麥、大麥、馬鈴薯、水稻、蘭花、橡樹、番茄、甜菜等。

本實驗應(yīng)用AFLP技術(shù)對特異物種的基因組DNA進行分析，找出差異DNA條帶并作進一步分析。

實驗操作酶切與連接模板(50ng/ul)4ul接頭1ulEcolⅠ（4u/ul）1ulMseⅠ（4u/ul1ulT4DNAligase(3u/ul)1ul2×PCRbuffer2ulATP2ul(10mM)H2O8ul離心，混勻。程序：30℃，4小時。8℃過夜。在PCR儀中運行。預(yù)擴增模板2ul引物2×0.2uldNTP0.5ul10×PCRbuffer2.5ulTaq酶(2u/ul)0.5ulH2O19.1ul離心，混勻。程序：94℃2min94℃40s56℃30s30Cycle72℃80s72℃5min選擇性擴增

預(yù)擴增產(chǎn)物按1：20稀釋。稀釋后的樣品作為選擇性擴增的模板。模板2ul

引物(EcolⅠ和MseⅠ的引物各一種)2×0.2uldNTP1ul10×PCRbuffer5ulTaq酶(2u/ul)2ulH2O39.6ul

離心，混勻。程序：

94℃2min94℃30s65℃30s72℃80stouchdown每輪0.7℃，共12輪。94℃30s55℃30s

72℃80s擴增23輪。銀染樣品的準(zhǔn)備：選擇性擴增的產(chǎn)物與甲酰胺上樣緩沖液（98%甲酰胺，10mMEDTA,0.25%溴酚蘭）2：1混勻，95℃變性8分鐘，立即冰浴，待用。6%變性膠的制備、電泳1、6%Arc/Bis膠貯液尿素420.42gArc60g定容到1L，過濾。

Bis3.16g4℃保存。10×TBE50ml2、膠的制備6%Arc/Bis50ml10%AP250ul10×TBE50ul3、玻璃板的消化及組裝洗凈的玻璃板淋干，用95%的酒精沖洗2遍，干燥。用吹風(fēng)機預(yù)熱玻璃板。分別向兩板上用擦鏡紙涂300ml剝離硅烷。通風(fēng)廚中干燥30分鐘。組裝。灌膠。4、預(yù)電泳向上槽液中加入0.5×TBE，下槽液中加入1×TBE，300V電泳半小時。5、上樣、電泳吹凈加樣孔中的尿素和氣泡。上樣。250V電泳4小時。銀染1、固定：10%的乙醇和0.5%冰醋酸固定6分鐘，分兩次進行，可過夜2、染色：0.2%硝酸銀溶液中浸泡20分鐘，時間可稍長。3、漂洗：蒸餾水充分漂洗。2-3遍。4、顯色：1.5%氫氧化鈉和0.4%甲醛顯色。預(yù)冷。10℃最好。5、終止：0.75%碳酸氫鈉溶液。6、膠可在固定液中保存幾天。7、也可制備干膠。制備前，將膠和剝離紙在5%的甘油溶液中浸泡3小時。目的DNA的回收用刀片切取差異條帶，置于Ep管中。加入100ul雙蒸水，室溫靜置10分鐘。煮沸15分鐘。高速離心2分鐘。棄沉淀，留上清。向上清中加入10ul,3mol/l,PH5.2,NaAc;5ul,10mg/ml糖原；400ul,100%乙醇?；靹?。-70℃放置30分鐘，或者-20℃更長時間。4℃高速離心10分鐘。棄上清。加入500ul，85%乙醇洗沉淀。干燥，溶于10ul雙蒸水。取4ul進行PCR反應(yīng)，其余-20℃保存。第二部分植物基因克隆技術(shù)系列實驗第一單元：用差異顯示法分離特異表達(dá)的基因片段

差式顯示（Differentialdisplay）是由Liang和Pardee在1922年建立的一種新的分子生物學(xué)技術(shù)，其目的就是對不同細(xì)胞的mRNA進行比較，尋找特異表達(dá)的基因。由于該方法簡便直觀，目前在動物、植物中已有很多成功應(yīng)用。

差式顯示的基本策略是通過反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析膠（6%~8%polyacrylamidegel）同步分離顯示擴增產(chǎn)物以進行比較。首先，要以5’-T(n)MN-3’(3’固定引物，3’anchoredprimer，其中n=10~20,M=dA/dC/dG,N=dA/dC/dT/dG)作引物，將待比較的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到單鏈cDNA為模板,由于該引物具有poly(dT),故可與mRNA的3’-poly(A)結(jié)合，而另外兩個堿基MN的作用是使它定位在poly(A)的5’端，并使它只介導(dǎo)約1/12的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄（為什么？）。

逆轉(zhuǎn)錄之后，以單鏈cDNA為模板，立即進行PCR,3’端就是上述3’固定引物，5’端引物是10~13個堿基的隨機引物（5’arbitraryprimer）。對于在細(xì)胞A中表達(dá)而不在細(xì)胞B中表達(dá)的基因來說，若引物合適，就可能在A的PCR產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的基因片段，而不會在細(xì)胞B的PCR產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)該片段。由于5’端引物較短，特異性較低，能以相對較高的機率與cDNA5’端結(jié)合，從而保證每一對引物都能擴增出適當(dāng)數(shù)量的DNA片段（約50~150條）。若片段數(shù)過少，要對全部mRNA進行比較就必須合成大量引物，進行大量PCR；若片段數(shù)過多，又會增加分離純化的難度，當(dāng)每次PCR擴增50~150個片段時，通過對12個3’引物和25個5’引物的不同組合，可以在95%的情況下分析15000個不同的基因，基本包括單個細(xì)胞所能表達(dá)的全部基因數(shù)。

由于PCR的產(chǎn)物一般含有幾十至上百個分子量相近的DNA片段，所以需要用高分辨率的測序膠（6%~8%的聚丙烯酰胺凝膠）來分離這些片段。

PCR產(chǎn)物分離后的顯色，本實驗采用銀染法。

顯色后我們會看到很多條帶，其中大多數(shù)是共有的，但在某些位置上會有特異的條帶，這些條帶就是我們要找的特異表達(dá)的基因片段。

銀染法的原理是利用了DNA對銀離子的吸附作用，將吸附的銀離子還原成金屬銀，從而顯示DNA條帶的位置。其優(yōu)點是靈敏度高，顯色快速簡單，可在電泳后幾十分鐘內(nèi)得到結(jié)果。使用放射性同位素雖可達(dá)到近似的靈敏度，但一般需曝光幾十小時以上，并且要求PCR中摻入同位素，因此對防護的要求較高，使操作復(fù)雜化。

銀染法的缺點是必須將DNA固定在膠上才能有好的染色效果，這就使得從膠上回收特異的DNA片段進行后續(xù)實驗十分困難，所以在實際操作中并不使用。

操作步驟1．

RNA制備1)液氮研磨，材料剪碎直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg組織/mlTrizol加入Trizol，轉(zhuǎn)入離心管進行第2步操作。2）室溫放置5min，使其充分裂解。注：此時可放入-70℃長期保持。3）12,000rpm離心5min，棄沉淀。4）按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。注：禁用漩渦振蕩器，以免基因組DNA斷裂。5）4℃12,000g離心15min。6）吸取上層水相，至另一離心管中。注：千萬不要吸取中間界面。7）按0.5ml異丙醇/mlTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5-10min。8）4℃12,000g離心10min，棄上清，RNA沉于管底。9）按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。10）4℃8,000g離心5min，盡量棄上清。11）室溫晾干或真空干燥5-10min。

注：RNA樣品不要過于干燥，否則很難溶解。12）可用50ulH2O，TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA樣品，55-60℃,5-10min。

注：H2O、TE或0.5%SDS均須用DEPC處理并高壓。2．逆轉(zhuǎn)錄：1）按下列方法建立四套不同的簡并oligo(dT)錨定引物（T7T12MG,T7T12MA,T7T12MC,T7T12MT）5×RTbuffer4ul

dNTP1(1mM):1ul

總RNA:0.2ug(或mRNA0.1ug)

T7T12MN:1ul

加水補足：19ul

離心數(shù)秒混勻。2）65℃溫育2min，37℃溫育5min；3）加入1ulM-MLV(RNaseH-)反轉(zhuǎn)錄酶，離心數(shù)秒，37℃50min；4）95℃溫育5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，稍加高速離心以收集液滴，可立即用于PCR擴增，或貯存于-20℃，用于下面實驗。3PCR差異顯示mRNA：1）對于每一套引物按以下方案準(zhǔn)備20ul反應(yīng)液：10×PCRbuffer:2uldNTP2(0.2mM):1ulT7T12MN:1ulM13十聚體隨機引物：1ulcDNA(RT產(chǎn)物)：2ulTaq-plus:0.5-1ul加水補足：20ul2）離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進行PCR擴增：94℃預(yù)變性2min94℃變性30秒40℃復(fù)性20秒40循環(huán)72℃延伸60秒72℃延伸加時10min4.測序膠分離PCR產(chǎn)物配膠：5.7g丙烯酰胺，0.3gN,N’-甲叉雙丙烯酰胺,48克尿素，放入200mL燒杯中，加入20mL5×TBE,20mL重蒸水，攪拌溶解，由于尿素溶解時吸熱，故可將燒杯置于37℃水浴促溶。待完全溶解后，定容至100mL，Wattman3MM濾紙過濾，然后于4℃避光保存?zhèn)溆?。另外配?0%過硫酸銨溶液0.5mL，注意一定要現(xiàn)用現(xiàn)配。膠板的準(zhǔn)備：將兩塊玻璃板洗凈，蒸餾水沖洗一遍，晾干。用脫脂棉蘸2~3mL疏水硅化液在長方形玻璃板上均勻涂抹至干，用裝無水乙醇的洗瓶自上至下沖洗一遍，沖掉未結(jié)合上的硅化液，晾干備用。在凹形玻璃板上用親水硅化液5mL同法進行親水硅化。灌膠：在兩塊玻璃板之間兩側(cè)各夾上一個0.4mm厚與膠板等長的塑料間隔片（spacer），用膠布將三面封死，用鐵夾夾緊。在100mL配好的聚丙烯酰胺凝膠貯液中加入0.5mL10%過硫酸銨，輕搖混勻，再加入50μLTEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），輕搖混勻，注意不起氣泡。然后將立起膠板，稍傾斜，將配好的膠沿玻璃板慢慢倒入膠板間的空隙，注意不要再膠中留著氣泡。若已產(chǎn)生氣泡，可將膠板適當(dāng)傾斜以使膠面降至氣泡以下，氣泡會自然破裂。倒?jié)M膠厚，水平放置膠板，將梳子的平面插入兩板之間約4~5mm，用鐵夾固定，靜置1h左右使膠聚合完全。上樣：膠凝厚，撕去膠布，輕輕撥出，注意不要損壞膠面。用注射器水沖洗膠面，洗掉碎膠。反轉(zhuǎn)梳子，將鋸齒面插入兩板之間，使齒尖稍進入膠面（約0.5mm），數(shù)字齒之間的間隙即是樣品槽。把膠板固定在電泳槽上，槽中加入1×TBE至沒過膠面。用1900V預(yù)電泳20min，同時將樣品于80~100℃加熱變性2min后立即置于冰上，使其保持單鏈狀態(tài)。停止預(yù)電泳，用注射器灌電泳液將膠面上析出的尿素沖掉，即可開始上樣。上樣使用微量進樣器，每個樣品取10μ左右。

注意，每一對樣品必須相鄰并且同時電泳。電泳：上完樣后，立即開始電泳。電壓設(shè)為1900V左右。電泳時注意不要使膠的溫度太高，必要時可將鐵板夾在玻璃板上幫助散熱。電泳至第二道染料（二甲苯菁FF）即將出膠時停止（一般需2~4h）。放掉電泳液，取下膠板，將兩塊板輕輕撬開，膠將會留在親水硅化過的板上。5.銀染拿膠板時應(yīng)戴手套，拿膠板的邊緣，以防止指紋。固定：膠面向上將膠板放入一個淺塑料盤中，倒入固定液，使其沒過膠面。輕輕搖晃20min左右至看不見膠上的染料時，將板取出。注意回收固定液。洗膠：用重蒸水浸泡膠板2min，取出后瀝干10~20s，換水浸泡。重復(fù)三次。染色：將板轉(zhuǎn)入染色液，輕搖30min。顯色（注意要嚴(yán)格控制各步的時間）：a：將3mL甲醛及400μL硫代硫酸鈉（10mg/mL）溶液加入10~20℃的顯色液中。b：從染色液中取出膠板，重蒸水中浸泡5~10s，立即取出（若超出時間，須重復(fù)染色步驟）。c：將膠板置于1L預(yù)冷的顯色液中，充分振蕩，直至看見第一個條帶，然后將膠板轉(zhuǎn)至另1L顯色液中，繼續(xù)顯色2~3min，至其余條帶清晰可見。終止顯色：將回收的等體積固定液直接倒入顯色液中，搖2~3min終止顯色。清洗：用重蒸水浸泡兩次，每次2min。干燥：將膠板置于室溫晾干。然后，在淺色背景下即可進行觀察。結(jié)果與討論1.PCR是一種高度靈敏的DNA擴增反應(yīng)，它可把單個DNA分子擴增105倍以上。反應(yīng)體系中微量的DNA污染都可能對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，因此在配制PCR反應(yīng)混合物時應(yīng)非常小心，所用的tip頭應(yīng)是滅菌的新tip頭，每加一種試劑應(yīng)換一個頭。模板DNA應(yīng)最后加，以盡可能減少污染的幾率。由于本實驗要對兩組cDNA進行比較，所以二者的反應(yīng)條件應(yīng)盡可能相同，以免引入虛假的差別。為達(dá)到此