高中生物競賽課件：顯微鏡和顯微技術(shù)

顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的因素：放大倍數(shù)被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！特定條件下能辨析的兩點之間的最小距離分辨率觀察效果的最重要指標顯微鏡和顯微技術(shù)決定顯微觀察效果的因素：放大倍數(shù)被觀察物越小，放大倍數(shù)應(yīng)越大，否則難以看清！特定條件下能辨析的兩點之間的最小距離被觀察物區(qū)別于背景的程度

與顯微鏡的自身特點有關(guān)，但也取決于進行顯微觀察時對顯微鏡的正確使用及良好的標本制作和觀察技術(shù)，這就是顯微技術(shù)分辨率反差觀察效果的最重要指標病毒20-200nm支原體0.1-0.3μm細菌0.5-5.0μm動植物細胞20-30μm活細胞多是無色透明的肉眼0.2mm光學顯微鏡0.2μm電子顯微鏡0.2nm掃描隧道顯微鏡樣品制備技術(shù)直徑分辨率顯微鏡和顯微技術(shù)從細胞的發(fā)現(xiàn)、細胞學說的建立，直至今天光學顯微鏡仍然是細胞生物學研究的重要工具1.目鏡2.準焦螺旋3.物鏡4.載物臺5.反光鏡組成部分？成像原理？樣品制備？顯微鏡和顯微技術(shù)顯微鏡的種類普通光學顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡顯微鏡和顯微技術(shù)（一）普通復(fù)式光學顯微鏡——組成由3部分組成：光學放大系統(tǒng)(目鏡與物鏡)照明系統(tǒng)(光源和聚光鏡)(有時另加濾光片以控制波長范圍)鏡架及樣品調(diào)節(jié)系統(tǒng)顯微鏡最重要的性能參數(shù)：分辨率，字母D表示決定因素：光源的波長λ物鏡鏡口角α(標本在光軸上的一點對物鏡鏡口的張角）介質(zhì)折射率N

數(shù)值孔徑值NA（鏡口率）決定物鏡性能最重要的指標（一）普通復(fù)式光學顯微鏡——分辨率顯微鏡最重要的性能參數(shù)：分辨率，字母D表示決定因素：光源的波長λ物鏡鏡口角α(標本在光軸上的一點對物鏡鏡口的張角）介質(zhì)折射率N

數(shù)值孔徑值NA（鏡口率）決定物鏡性能最重要的指標（一）普通復(fù)式光學顯微鏡——分辨率分辨率與所用波長成反比！最短可見光波長λ=400nm(450nm)最大物鏡鏡口角α=140°空氣折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，約為0.3μm如何提高顯微鏡的分辨能力？縮短波長增大數(shù)值孔徑介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油鏡下，D可達0.18μm普通光學顯微鏡最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光學顯微鏡有效的最高放大倍數(shù)只有1000-1500倍

（一）普通復(fù)式光學顯微鏡——分辨率最短可見光波長λ=400nm(450nm)最大物鏡鏡口角α=140°空氣折射率N=1

分辨率D=260nm(292nm)，約為0.3μm如何提高顯微鏡的分辨能力？縮短波長增大數(shù)值孔徑介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66油鏡下，D可達0.18μm普通光學顯微鏡最大分辨率0.18μm。肉眼分辨能力0.25mm，光學顯微鏡有效的最高放大倍數(shù)只有1000-1500倍

（一）普通復(fù)式光學顯微鏡——分辨率很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。（二）暗視野顯微鏡普通光學顯微鏡又稱明視野顯微鏡，其照明光線直接進入視野，屬透射照明光闌樣品與背景之間的反差增大暗視野顯微鏡特點：特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明光不直接穿過物鏡，由樣品反射或折射后進入物鏡視野是暗的，樣品是明亮的觀察更容易、清晰（二）暗視野顯微鏡普通光學顯微鏡又稱明視野顯微鏡，其照明光線直接進入視野，屬透射照明光闌樣品與背景之間的反差增大暗視野顯微鏡特點：特殊的聚光器實現(xiàn)斜射照明光不直接穿過物鏡，由樣品反射或折射后進入物鏡視野是暗的，樣品是明亮的觀察更容易、清晰蒼白密螺旋體團藻（三）相差顯微鏡光波的基本屬性包括：波長、頻率、振幅和相位；波長和頻率變化è顏色不同；振幅變化è亮度不同；相位變化人眼無法覺察；相差顯微鏡：利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實現(xiàn)對非染色活細胞的觀察相差顯微鏡：利用光線干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，實現(xiàn)對非染色活細胞的觀察A.

兩束光的相位相同è相互干涉的結(jié)果使光波的振幅↑，亮度↑B.兩束光的相位相反è光波的振幅↓，亮度↓（三）相差顯微鏡相差顯微鏡在普通光學顯微鏡的基礎(chǔ)上，添加“環(huán)狀光闌”和“相差板”，將光程差或相位差，轉(zhuǎn)換成振幅差（三）相差顯微鏡（三）相差顯微鏡荷蘭人FritsZernike(F·澤爾尼克)1930年，發(fā)明相襯方法(相差顯微鏡)1941年，制造出第一臺相差顯微鏡1953年，諾貝爾物理學獎釀酒酵母草履蟲（四）熒光顯微鏡——基本原理光鏡水平上對細胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)以及某些離子等組分進行定性定位研究的有力工具熒光：分子吸收入射光能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)而發(fā)出的可見光(波長比入射光長)，可分為自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光濾光片系統(tǒng)由激發(fā)濾光片和阻斷濾光片組成激發(fā)光片：光源和樣品之間，只允許特定波長的激發(fā)光通過；阻斷濾光片：物鏡和目鏡之間，只允許熒光染料所發(fā)出的熒光通過；光源和光學系統(tǒng)與普通光學顯微鏡不同核心部件是濾光片系統(tǒng)及專用物鏡鏡頭吸收短波長的光，發(fā)射長波長的光（四）熒光顯微鏡（四）熒光顯微鏡蒼白密螺旋體（四）熒光顯微鏡鼠疫耶爾森菌“照亮細胞”的綠色熒光蛋白Greenfluorensentprotein)2008年，諾貝爾化學獎授予發(fā)現(xiàn)和修飾GFP的3位科學家美國下村修美國馬丁.查爾菲美國錢永?。ㄋ模晒怙@微鏡電子顯微鏡(Electronmicroscope,EM)TheNobelPrizeinPhysics1986

觀察細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)1932年由Ruska制成1986年獲諾貝爾物理學獎透射電鏡

transmissionelectronmicroscope,TEM掃描電鏡

scanningelectronmicroscope,SEM電子顯微鏡(Electronmicroscope,EM)電子顯微鏡的基本知識電子束作為光源，波長一般<0.1nm電磁透鏡聚焦鏡筒高度真空圖像通過熒光屏、感光膠片或電荷耦合器件顯示和記錄1、與光學顯微鏡的基本區(qū)別分辨率光源透鏡真空成像原理光學顯微鏡200nm可見光，波長400-700nm玻璃透鏡不要求真空樣本對光的吸收形成明暗反差和顏色變化電鏡0.2nm電子束，波長0.01-0.9nm電磁透鏡1.33×10-3~1.33×10-5Pa樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡的基本知識1、與光學顯微鏡的基本區(qū)別電子顯微鏡分辨率可達0.2nm人眼分辨率0.2mm，光學顯微鏡0.2μm，放大倍數(shù)1000，電鏡0.2nm，放大倍數(shù)106，稱為有效放大倍數(shù)，通過光學手段繼續(xù)放大，不會得到任何有意義的信息，稱為“空放大”電鏡分辨率≠分辨本領(lǐng)分辨本領(lǐng)指電鏡處于最佳狀態(tài)下的分辨率影響因素：生物制樣技術(shù)的限制(超薄切片樣品中分辨率約為切片厚度1/10，即50nm厚度切片的實際分辨率為5nm,<<電鏡分辨率0.2nm)2．電子顯微鏡的分辨本領(lǐng)與有效放大倍數(shù)電子顯微鏡的基本知識4個組成部分：電子束照明系統(tǒng)電子槍+聚光鏡成像系統(tǒng)物鏡+中間鏡+投影鏡真空系統(tǒng)電子槍，鏡筒及記錄系統(tǒng)內(nèi)高真空記錄系統(tǒng)熒光顯示屏/感光膠片/CCD相機3．電子顯微鏡的基本構(gòu)造電子顯微鏡的基本知識掃描隧道顯微鏡

(Scanningtunnelmicroscope,STM)1981年發(fā)明，1986年Binnig和Rohrer獲諾貝爾物理學獎原理：在低電壓下，當兩電極之間近到一定距離(d)（50nm以內(nèi)）時，電極之間產(chǎn)生電流，稱為隧道電流(I)，隧道電流I和針尖與樣品之間的距離d呈指數(shù)關(guān)系，距離可轉(zhuǎn)化為電流的函數(shù)被測