熒光光譜分析法121220

熒光分析法第一節(jié)熒光分析法的基本原理第二節(jié)熒光定量分析方法第三節(jié)熒光分光光度計(jì)12008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

下村修:現(xiàn)年80歲的下村修1928年出生于日本京都府，1960年獲得名古屋大學(xué)理學(xué)博士學(xué)位后赴美，先后在美國普林斯頓大學(xué)、波士頓大學(xué)和伍茲霍爾海洋生物實(shí)驗(yàn)所工作。他1962年從一種水母中發(fā)現(xiàn)了熒光蛋白，被譽(yù)為生物發(fā)光研究第一人。馬丁·沙爾菲:馬丁·沙爾菲出生于1947年，現(xiàn)年61歲，是美國哥倫比亞大學(xué)生物學(xué)教授。他獲獎(jiǎng)的主要貢獻(xiàn)在于向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的遺傳標(biāo)簽的作用，這一技術(shù)被廣泛運(yùn)用于生理學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。瑞典皇家科學(xué)院宣布，美籍華裔科學(xué)家錢永健、美國生物學(xué)家馬丁·沙爾菲和日本有機(jī)化學(xué)家兼海洋生物學(xué)家下村修共同獲得2008年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，將均分1000萬瑞典克朗（約合140萬美元）獎(jiǎng)金。幫助他們獲獎(jiǎng)的是綠色熒光蛋白。這種蛋白為生物與醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)帶來革命，它發(fā)出的熒光像一盞明燈，幫助研究人員照亮生命體在分子層面和細(xì)胞層面的諸多反應(yīng)。

由于綠色熒光蛋白用紫外線一照就發(fā)出鮮艷綠光，研究人員將綠色熒光蛋白基因插入動(dòng)物、細(xì)菌或其他細(xì)胞的遺傳信息之中，讓其隨著這些需要跟蹤的細(xì)胞復(fù)制，可“照亮”不斷長大的癌癥腫瘤、跟蹤阿爾茨海默氏癥對(duì)大腦造成的損害、觀察有害細(xì)菌的生長，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如何產(chǎn)生分泌胰島素的β細(xì)胞。2

某些物質(zhì)被一定波長的光照射時(shí)，會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)射出波長比入射光長的光，如果這個(gè)時(shí)間比較短，這種光就稱為熒光。熒光由一種能發(fā)熒光的礦物

螢石(fluospar)而得名。

我們這里要介紹的熒光，是指物質(zhì)在吸收紫外光和可見光后發(fā)出的波長較長的紫外熒光或可見熒光。除了紫外光和可見光可能激發(fā)熒光外，其它的光如紅外光、X射線也可能激發(fā)出熒光，因此除紫外熒光或可見熒光外，還有紅外熒光、X射線熒光等。34用熒光抗體染色之原生動(dòng)物澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動(dòng)物通過發(fā)出色彩鮮艷的熒光來恐嚇警告敵對(duì)者或者吸引性配偶。

5K.Brejcet.al.,PNAS94(1997)23061nmgreen-fluorescentprotein(GFP)6某些物質(zhì)受到光照射，除吸收某種波長的光之外，發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光——光致發(fā)光（二級(jí)光）。光致發(fā)光熒光fluorescence磷光phosphorescence熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線的位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的儀器方法。

7光學(xué)光譜區(qū)遠(yuǎn)紫外近紫外可見光近紅外中紅外遠(yuǎn)紅外（真空紫外）10nm~200nm200nm

~380nm380nm

~780nm780nm~2.5m2.5m

~50m50m

~300m8分子熒光分析的特點(diǎn)：靈敏度高：一般紫外一可見分光光度法的檢出限約為10-7g/ml，而熒光分析法的檢出限可達(dá)到10-10甚至10-12

g/ml。選擇性好線性范圍寬應(yīng)用范圍窄9第一節(jié)熒光分析法的基本原理1.分子熒光的產(chǎn)生一、分子熒光

molecularfluorescence★分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜★在分子體系中，每個(gè)電子能級(jí)上都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能層★室溫下大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層★在基態(tài)時(shí)，含有偶數(shù)個(gè)電子的分子，電子的ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為基態(tài)單重態(tài),用符號(hào)S0表示10分子吸收輻射后電子被激發(fā)且不發(fā)生自旋方向的改變ms為+1/2和-1/2,s=0，M=1。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)單重態(tài),用符號(hào)S表示。（S1S2S3…）電子被激發(fā)且伴隨著自旋方向的改變ms為+1/2和+1/2,s=1，M=3。則該分子所處的電子能態(tài)稱為激發(fā)三重態(tài),用符號(hào)T表示。（T1T2T3…）S011

小結(jié)：分子能級(jí)與躍遷

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式(見能級(jí)圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)，發(fā)生的幾率大；第一、第二、…電子激發(fā)單重態(tài)S1、S2…

；

第一、第二、…電子激發(fā)三重態(tài)T1、T2…

；電子能級(jí)的多重性M=2S+1

平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；12S0→S1、S2

允許躍遷；S0→T1、T2禁阻躍遷；通過其他途徑進(jìn)入(見能級(jí)圖)；進(jìn)入的幾率??；小結(jié)：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)的不同

激發(fā)單重態(tài)分子中沒有凈電子自旋，因而具有反磁性；激發(fā)三重態(tài)有2個(gè)自旋平行電子，是順磁性的

激發(fā)單重態(tài)分子平均壽命短（10-8~10-6s），而激發(fā)三重態(tài)的長（10-4~10s）基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)，不涉及電子自旋方向的改變而容易發(fā)生，屬于允許躍遷；而到激發(fā)三重態(tài)屬于禁阻躍遷13S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

4

外轉(zhuǎn)換l

3T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫14激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；熒光延遲熒光磷光輻射躍遷無輻射躍遷傳遞途徑內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛豫熒光：10-7～10-9s，第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)磷光：10-4～10s；

第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)15輻射和非輻射能量傳遞過程振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)中，以熱能量交換形式由高振動(dòng)能層至低相鄰振動(dòng)能層間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s內(nèi)轉(zhuǎn)換：相同多重態(tài)的電子能級(jí)間的等能級(jí)的無輻射躍遷。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。發(fā)生內(nèi)轉(zhuǎn)換的時(shí)間10-13s。熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能層→基態(tài)(熒光多為S1→S0躍遷)，發(fā)射波長為3的熒光，10-7~10-9s。

發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長：

3>2>1；16系間跨越：激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的非輻射躍遷。禁阻躍遷，但當(dāng)能層有較大重疊時(shí)S1T1

就可發(fā)生系間跨越，通過自旋—軌道耦合進(jìn)行。10-6s外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子之間碰撞引起的轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷。常發(fā)生在S1或T1S0

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)(T1→S0躍遷)；發(fā)光速度很慢：10-4~100s、磷光的能量比熒光小

電子由S0進(jìn)入T1的過程：（S0→T1禁阻躍遷）

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間跨越→振動(dòng)弛豫→T1

光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間172.熒光的激發(fā)光譜與熒光光譜excitationspectrumandfluorescencespectrum（1）熒光的激發(fā)光譜激發(fā)光譜：表示不同激發(fā)波長下所引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對(duì)效率。

繪制激發(fā)光譜：固定發(fā)射波長(選最大發(fā)射波長),然后以不同波長的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)，以熒光強(qiáng)度F對(duì)激發(fā)波長作圖，即為激發(fā)光譜。熒光分子都具有兩個(gè)特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）。18激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大，稱為最大激發(fā)波長ex（2）熒光的發(fā)射光譜（熒光光譜）熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制發(fā)射光譜時(shí)，使激發(fā)光波長固定在ex處，然后對(duì)發(fā)射光譜掃描，測定各種波長下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度F

對(duì)發(fā)射波長作圖，得發(fā)射光譜圖（即熒光光譜）。發(fā)射光譜（熒光光譜）的位置？磷光光譜的位置？1920激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

a.Stokes位移

熒光光譜總是位于物質(zhì)激發(fā)光譜的長波一側(cè)，即熒光波長大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值：振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換等物輻射躍遷損失了部分能量。

b.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

電子可以躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長的能量(如能級(jí)圖2、1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但熒光光譜卻只有一個(gè)發(fā)射態(tài)，如3。為什么？21c.

鏡像規(guī)則由于電子基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布與激發(fā)態(tài)相似，故通常熒光光譜與它的激發(fā)光譜成鏡像對(duì)稱關(guān)系。各小峰波長遞減值與振動(dòng)能級(jí)差有關(guān)，各小峰的高度與躍遷幾率有關(guān)。22

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類似；

基態(tài)上的某振動(dòng)能級(jí)若躍遷到第一激發(fā)態(tài)的某振動(dòng)能級(jí)的幾率較大的話，相反躍遷也如此。

23二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure

1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結(jié)構(gòu)；（2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率（）：物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率范圍一般是多少?如果一個(gè)分子將吸收的光子全部釋放，則其量子產(chǎn)率為100%。242.有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（1）躍遷類型：*→的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生；（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電子基，使熒光增強(qiáng)。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒有。2526三、影響熒光強(qiáng)度的因素

relationbetweenfluorescenceandmolecularstructure影響熒光強(qiáng)度的外部因素1.溶劑的影響同一物質(zhì)在不同溶劑中，其熒光光譜的形狀和強(qiáng)度都有差別。一般情況下，熒光波長隨著溶劑極性的增大而長移，熒光強(qiáng)度也有所增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，ππ*躍遷所需的能量差△E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長和熒光波長均長移，強(qiáng)度也增強(qiáng)。溶劑粘度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對(duì)溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。272.溫度的影響

熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞的幾率增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加，熒光效率降低。例如熒光素鈉的乙醇溶液，在0℃以下，溫度每降低10℃，f增加3％，在80℃時(shí)，f為1。28當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的pH值對(duì)該熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度有較大影響，這主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，離子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此熒光強(qiáng)度也有差異。每一種熒光物質(zhì)都有它最適宜的發(fā)射熒光的存在形式，也就是有它最適宜的pH值范圍。例如苯胺在不同pH值下有下列平衡關(guān)系：

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，由于NH2為提高熒光效率的取代基，故苯胺分子會(huì)發(fā)生藍(lán)色熒光。但在pH<2和pH＞13的溶液中均以苯胺離子形式存在，故不能發(fā)射熒光。3.溶液pH

對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；294.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；305.熒光熄滅劑熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑(quenchingmedium)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物均為常見的熒光熄滅劑。316、散射光小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長與入射光波長相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光。散射光對(duì)熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，與熒光波長接近，對(duì)測定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長32 選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長可消除拉曼光的干擾a:320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm。b:將空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定熒光，激發(fā)光波長為320nm時(shí)，拉曼光波長是360nm，360nm的拉曼光對(duì)熒光無影響；當(dāng)激發(fā)光波長為350nm時(shí)，拉曼光波長是400nm，400nm的拉曼光對(duì)熒光有干擾，因而影響測定結(jié)果。

硫酸奎寧在不同波長激發(fā)下的熒光與散射光譜

33四、熒光試劑熒光試劑是一種可以使非熒光物質(zhì)或弱熒光物質(zhì)與其反應(yīng)之后，得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物的標(biāo)記物，從而可擴(kuò)大熒光分析法的使用范圍1.有機(jī)化合物的熒光分析脂肪族化合物能產(chǎn)生熒光的為數(shù)不多。芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物，因存在共軛體系而容易吸收光能，在紫外光照射下很多能發(fā)射熒光。有時(shí)為了提高測定的靈敏度和選擇性，常使弱熒光性物質(zhì)與某些熒光試劑作用，以得到強(qiáng)熒光性產(chǎn)物(衍生化)。因此，熒光分析法在有機(jī)物測定方面的應(yīng)用很廣。34能用熒光分析法測定的有機(jī)物包括多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)等；藥物中的生物堿類如麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿等；甾體類如皮質(zhì)激素及雌醇等；抗生素類如青霉素、四環(huán)素等；維生素類如維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺等。此外，中草藥中的許多有效成分，不少是屬于芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類，都能產(chǎn)生熒光，可用熒光分析法作初步鑒別及含量測定。熒光分析法的靈敏度高，選擇性較好，取樣量少，方法快速，已成為醫(yī)藥學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域進(jìn)行科學(xué)研究工作的重要手段之一。以下是幾個(gè)重要的熒光試劑：35

1．熒光胺(fluorescamine)：能與脂肪族或芳香族伯胺類形成高度熒光衍生物，典型反應(yīng)如下： 熒光胺及其水解產(chǎn)物不顯熒光。100mg熒光胺溶于100ml無水丙酮中，放置24小時(shí)后即可使用。取相當(dāng)于10mg藥物的甲醇或水溶液0.lml，加適宜pH值的磷酸緩沖溶液5ml，加熒光胺試劑0.lml，混合，放置15分鐘后測定熒光強(qiáng)度。熒光條件為：λex=275、390nm，λem=480nm。362．鄰苯二甲醛(OPA)

在2巰基乙醇存在下，pH9～10的緩沖溶液中OPA能與伯胺類、特別是除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的a氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。取OPA500mg溶于10ml乙醇中，加200ml2巰基乙醇，將此混合液加至1L3％的硼酸溶液中，再用KOH調(diào)節(jié)至pH10，即為常用試劑溶液。熒光條件為：λex=340nm，λem=455nm。373．1二甲氨基5氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯)能與伯胺、仲胺及酚基的生物堿類反應(yīng)生成熒光性產(chǎn)物。取50mg或100mg試劑，溶解于500ml無水丙酮中即可使用。與丹酰氯類似的一個(gè)試劑是丹酰肼(Dansyl－NHNH2)，它能與可的松的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件為：λex=365nm，λem=500nm左右。丹酰氯試劑不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物DansylOH呈藍(lán)色熒光，必須暗處保存，每周重新配制。382.生物與有機(jī)化合物的分析39無機(jī)離子一般不顯熒光，與有機(jī)試劑形成有熒光的配合物后，可測量約60種元素及離子鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土——采用熒光分析法氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳——采用熒光熄滅法測定銅、鐵、鈷、鋨及過氧化氫——采用催化熒光法測定鉻、鈮、鈾、碲——采用低溫?zé)晒夥y定鈰、銪、銻、釩、鈾——采用固體熒光法測定2.無機(jī)化合物的分析40第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系當(dāng)一束強(qiáng)度為I0的紫外/可見光照射一濃度為c、液層厚度為d的液槽時(shí)，可在溶液的各個(gè)方向觀察到熒光，其由于能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)占被分析物的數(shù)量相當(dāng)有限，且就這少量的熒光物質(zhì)幾乎在同一波長段產(chǎn)生光致發(fā)光，所以熒光法很少用來定性分析

吸收光強(qiáng)度為Ia透過光強(qiáng)度為It熒光強(qiáng)度為FI0It

IaF垂直方向41（=I0-It）熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度IaF=K’(I0–It)K’：取決于熒光效率f根據(jù)BeerLaw=10-clItI0F=K’(I0-

I010-cl)

=K’I0(1-

10-cl)

=K’I0(1-

e–2.303cl)由于ex=1+x+x2/2!+x3/3!+…+xn/n!所以e-2.3cl

=1-2.3cl

+(-2.3cl)2/2!+(-2.3cl)3/3!+…e-2.3cl

=1-2.3cl

42e-2.3cl

=1-2.3cl代入

F=

K’I0(1-

e–2.303cl

)F=K’I0(1-

1+2.3cl

)=2.3K’I0

lc

當(dāng)熒光效率f

、入射光強(qiáng)度I0、物質(zhì)的摩爾吸收系數(shù)

、液層厚度b均固定不變時(shí)，熒光強(qiáng)度正比于該溶液的濃度F=K

c熒光定量分析的依據(jù)熒光強(qiáng)度可以在很弱的背景下被檢測，這完全取決于檢測器的靈敏度，也是熒光分析方法靈敏度高的原因43二、定量分析方法1.標(biāo)準(zhǔn)曲線法

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度試樣，測定熒光強(qiáng)度，繪制F-c的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣的濃度2.比較法

在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣的熒光強(qiáng)度，比較之空白調(diào)0，標(biāo)品調(diào)100%或50%44第三節(jié)熒光分光光度計(jì)四個(gè)部分——激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器特殊點(diǎn)——有兩個(gè)單色器，光源與檢測器通常成直角單色器：選擇激發(fā)光波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器光源：氙燈、高壓汞燈、激光器(可見與紫外區(qū))檢測器：光電倍增管45儀

器

光

路

圖46儀器框圖該型儀器可進(jìn)行熒光、磷光和發(fā)光分析47熒光分光光度計(jì)

F95-96熒光分光光度計(jì)48F02-3M熒光分光光度計(jì)49F-4500熒光分光光度計(jì)501.光源：發(fā)出所需波長范圍內(nèi)的連續(xù)光譜，有足夠 的光強(qiáng)度,穩(wěn)定。

可見光區(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)

氙燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈（氣體放電光源）氫燈強(qiáng)度51氙燈氫燈鎢燈5253掃描激發(fā)光譜圖和發(fā)射光譜圖

8一羥基喹啉—A1熒光光譜圖

（注：ex-365nm（紫外）,em-512<300-800>）54測標(biāo)樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線55儀器實(shí)驗(yàn)條件的選擇5657熒光分析法在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

1.

有機(jī)污染物的測定：—直接熒光法測定環(huán)境有機(jī)污染物見表1?！g接熒光法測定環(huán)境有機(jī)污染物見表2。58表1.直接法測定環(huán)境中的有機(jī)污染物待測物線形范圍檢出限樣品文獻(xiàn)

苯胺0-2.0mg/L4.3μg/L環(huán)境水樣14揮發(fā)酚不明確2μg/L天然水151-萘酚5.0×10-7-1.0×10-5mol/L2.0×10-7mol/L合成樣162-萘酚1.0×10-7-1.0×10-5mol/L1.0×10-7mol/L酚類化合物（19種酚）1-60μg/L，2-100μg/L，4-200μg/L，100-1000μg/L，20-500μg/L

0.3-17μg/L水和廢水18揮發(fā)酚類化合物不明確不明確造紙廠廢水19苯酚0-0.5mg/L5.1μg/L水20十二烷基苯磺酸鈉不明確4.0ng/mL飲用水、污水2259表2.間接熒光法測定環(huán)境有機(jī)污染物

待測物反應(yīng)類型線形范圍檢出限樣品文獻(xiàn)甲醛縮合反應(yīng)5-100×10-92×10-9室內(nèi)空氣25含硫除草劑光化學(xué)反應(yīng)14-2912ng/mL

0.2-6ng/mL

河水27甲醛縮合反應(yīng)3-600μg/L0.6μg/L河水28甲基對(duì)硫磷降解反應(yīng)0-2.6μg/L5.2μg/L井水、河水29甲醛縮合反應(yīng)12-192ng/mL

0.3ng/mL

乙醇或天然水30苯電解作用4.7μmol/L-0.96mmol/L2.8μmol/L水樣31五種芳香類殺蟲劑

光化學(xué)反應(yīng)0.1-20ng/mL——0.11-15.7μg/

mL

0.02-22ng/mL

水樣33總?cè)┖靠s合反應(yīng)100-1000×10-930×10-9汽車尾氣

3460表2.續(xù)待測物反應(yīng)類型線形范圍

檢出限樣品

文獻(xiàn)氯苯類除草劑光化學(xué)反應(yīng)0.5-2.5μg/

mL

23-98ng/mL

水樣36多環(huán)芳烴光化學(xué)反應(yīng)1-20μg/

mL

0.05μg/

mL

土壤37甲醛縮合反應(yīng)2-100×10-90.2×10-9空氣38甲醛縮合反應(yīng)0.0136-13.62μmol/L6nmol/L空氣42對(duì)硝基苯酚降解反應(yīng)10-200ng/mL

3ng/mL水及廢水43敵敵畏偶聯(lián)反應(yīng)0-1.0mg/L0.022mg/L水樣45久效磷降解反應(yīng)0-3.2μg/

mL

4.0μg/L水樣46氯苯氧基類除草劑光化學(xué)反應(yīng)0.1-4.5μg/

mL

23-98ng/mL

水樣3661水中石油的測定—分子熒光方法:檢出限為0.001mg/L，正己烷

萃取,無污染等—紅外測油法：檢出限為幾到幾十mg/L，四氯化碳萃取污染嚴(yán)重等62環(huán)境中無機(jī)污染物的測定

水質(zhì)監(jiān)測：天然水、飲用水、污水中的鋁、硼、鈷、銅、鐵、錳、鉬、鎳、鉛、錫、鈾(2)、釩、鋅；氰化物、硝酸鹽態(tài)氮、亞硝酸鹽態(tài)氮、硫化物、等。飲用水中的砷、硼、鈹、鉻(2)、鐵、硒、硅、氟化物。土壤、水系沉積物

及固態(tài)污染物監(jiān)測：硼、鋅；石油烴、苯并芘等。

63利用蛋白質(zhì)的天然熒光檢測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化

氨基?；冈谑榛蛩徜囎饔孟聝?nèi)源熒光發(fā)射譜隨作用時(shí)間的變化,隨作用時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減小。表明隨作用時(shí)間的增加，該蛋白質(zhì)逐漸變性，發(fā)生去折疊，蛋白質(zhì)內(nèi)部的熒光生色團(tuán)逐漸暴露在極性水環(huán)境中。64NormalizedfluorescenceemissionspectraofDNA-boundcyaninedimers,identifiedbythecolorkeyonthesidebar.

65AnalysisofDNAStructure,DNABindingandDNADamageSingleNucleicAcidMoleculeDetectionNucleicAcidConformationalAnalysisDNABindingAssays

AssessingDNADamageAssaysforEnzymesthatModifyNucleicAcids66光鑷(opticaltweezers)光鑷是以光的力學(xué)效應(yīng)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種新型技術(shù)用光鑷可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞器以至生物大分子進(jìn)行非機(jī)械接觸的、無損的捕獲和操作。光鑷在生物學(xué)研究中的應(yīng)用，大都與熒光技術(shù)密切結(jié)合。所研究的細(xì)胞或生物大分子往往采用熒光探針進(jìn)行標(biāo)記。例如，用熒光探針標(biāo)記肌動(dòng)蛋白，結(jié)合光鑷技術(shù)，拍攝了單個(gè)“分子馬達(dá)”的運(yùn)動(dòng)情況。6768

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