分子發(fā)光分析

儀器分析2光譜分析原子光譜原子吸收原子發(fā)射原子熒光分子光譜分子吸收紫外-可見(jiàn)光譜紅外光譜分子發(fā)光3第八章分子發(fā)光分析法分子吸收能量激發(fā)為激發(fā)態(tài)釋放出能量基態(tài)電能化學(xué)能光能稱(chēng)為“發(fā)光”光的形式釋放熒光磷光分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光輻射躍遷非輻射躍遷以熱的形式釋放4

分子熒光/磷光分析法一、基本原理（一）熒光和磷光的產(chǎn)生

從分子結(jié)構(gòu)理論來(lái)討論分子中電子的能量狀態(tài)電子所處的能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)電子的多重態(tài)J=2S+1S：為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和S=0,J=1單重態(tài)S表示（所有電子都是自旋配對(duì)的）S=1,J=3三重態(tài)

T表示大多數(shù)基態(tài)分子都處于單重態(tài)電子在躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的變化（自旋平行）5基態(tài)單重態(tài)S

激發(fā)態(tài)單重態(tài)S

激發(fā)態(tài)三重態(tài)T

激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：⑴

S是抗磁分子(磁矩=0)，T是順磁分子(磁矩≠0)⑵

tS=10-8s,tT=10-4～1s；(發(fā)光速度很慢)⑶

基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷；⑷

激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低熒光的產(chǎn)生激發(fā)態(tài)分子輻射躍遷無(wú)輻射躍遷熒光磷光猝滅內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越振動(dòng)弛豫受激發(fā)分子的去活化過(guò)程7其中S0、S1和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài)T1和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。V=0、1、2、3、…表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)。

2．分子內(nèi)的光物理過(guò)程8S0S1S2T1吸光1吸光2振動(dòng)弛豫:在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。非輻射能量傳遞過(guò)程；9S0S1S2T1吸光1吸光2內(nèi)轉(zhuǎn)移:

當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近以至其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。（S1轉(zhuǎn)移S2）10S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3系間竄躍:指不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。11輻射能量傳遞過(guò)程熒光發(fā)射:電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)

S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3熒光得到最大波長(zhǎng)為λ3的熒光由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小

λ3>λ2

>λ112磷光發(fā)射:

電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過(guò)振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，這個(gè)躍遷過(guò)程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。S0S1S2T1吸光1吸光2熒光3磷光磷光13猝滅

指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱(chēng)為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別：

磷光是由激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)區(qū)別14(二)熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜:(ex)以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì),在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度即以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制曲線即可得到激發(fā)光譜曲線。發(fā)射光譜：(em)固定激發(fā)光波長(zhǎng)（最大）然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度即可繪制熒光發(fā)射光譜曲線Fλnm

激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜16在熒光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。17激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜磷光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒（磷）光光譜F200260320380440500560620λ18激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，由于振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)化消耗了能量b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖2,1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光c.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。

鏡像規(guī)則的原因

基態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動(dòng)能級(jí)分布類(lèi)似；

基態(tài)上的零振動(dòng)能級(jí)與第一激發(fā)態(tài)的二振動(dòng)能級(jí)之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。

20（三）熒光的影響因素

分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：

①分子必須具有與所照射的輻射頻率(紫外-可見(jiàn)光）相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)(π→π*和n→π*);才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。211.熒光效率它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示

熒光效率越高；物質(zhì)發(fā)射熒光越強(qiáng)kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)（與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)）ki為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和（化學(xué)環(huán)境）凡使kf

值升高而使ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。222.熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）躍遷類(lèi)型實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生躍遷而得到熒光。

（2）共軛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn)激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，增加體系的共軛度熒光效率一般也將增大，主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子23(3)剛性平面結(jié)構(gòu)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。24（4）取代基效應(yīng)芳環(huán)上取代基給電子基團(tuán)，熒光增強(qiáng)（-OH、-OR、-CN、-NH2）產(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團(tuán)減弱甚至?xí)鐭晒馊?COOH、-NO、-CO、鹵素鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速率253.金屬螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。但是，若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光2627

同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同。4．溶劑效應(yīng)

一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*

躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移。5．溫度的影響

一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時(shí)，熒光效率為100%。28（四）溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度1.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率。

If=

Ia

式中為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律A=-lgI/I0I=I0.10-A

Ia=I0-I=I0(1-10-A)

I0和I分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得

If=I0(1-10-kbc)29整理得：

If=2.3I0

kbc當(dāng)入射光強(qiáng)度I0和b一定時(shí)，上式為：

If=Kc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)kbc0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。

302、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應(yīng)折射率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應(yīng)熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用如氫鍵的生成同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度上升使熒光強(qiáng)度下降內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用增大碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的幾率增加酸度化合物所處狀態(tài)不同電子構(gòu)型上有所不同熒光強(qiáng)度和熒光光譜不同31323、熒光猝滅定義：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象類(lèi)型碰撞猝滅激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞,熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)靜態(tài)猝滅熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光的絡(luò)合物轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅猝滅劑與熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)的自猝滅濃度較高單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝滅溶解氧與熒光物質(zhì)33光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)樣品池I0

IIf發(fā)射單色器掃描發(fā)射光譜消除其它光線的干擾獲得所需的熒光檢測(cè)器顯示器與分光光度計(jì)的差別兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器互成直角光電倍增管二、熒光分析儀石英杯四個(gè)光學(xué)面35三、分子熒光分析法及其應(yīng)用1.熒光分析方法的特點(diǎn)（1）靈敏度高（2）選擇性強(qiáng)（3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單（4）提供比較多的物理參數(shù)2、熒光定量分析的方法方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系比較法同樣條件下，測(cè)定試樣溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，直接通過(guò)比例計(jì)算363、熒光分析法的應(yīng)用方法直接熒光法被測(cè)物本身有熒光被測(cè)物與試劑反應(yīng)后F與物質(zhì)的濃度成正比熒光猝滅法被測(cè)物使熒光熄滅由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定被測(cè)物的含量

間接熒光法某些陰離子奪取金屬絡(luò)合物中金屬離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體催化熒光法反應(yīng)速度慢，熒光微弱，難測(cè)定金屬離子將加速反應(yīng)進(jìn)行定性和定量分析二、定量分析熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系I0ItF一、定性分析F=KC形式相同于比爾定律——一定條件下，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比熒光強(qiáng)度

F正比于吸收的光量I和熒光效率：

F∝Ia

由朗-比爾定律：Ia=I0(1-e-lc)F∝

I0(1-10-lc)=

I0(1-e-2.3lc)

濃度很低時(shí)，將括號(hào)項(xiàng)近似處理后：

F=2.3I0lc

=Kc定量依據(jù)：熒光定量分析F=KC適用條件：①溶液很稀，A≤0.05；②線性范圍：10-5~100ug/ml。1.標(biāo)準(zhǔn)(工作)曲線法：F0CFxCx2.比例法：扣除空白時(shí)：42磷光分析法

1．如何獲得較強(qiáng)的磷光增加試樣的剛性: 低溫冷凍固體磷光法：

吸附于固相載體（濾紙）分子締合物的形成：

加入表面活性劑等

重原子效應(yīng)：

加入含重原子的物質(zhì)，如銀鹽等敏化磷光：

通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生磷光

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)

→基態(tài)，

T1

→

S0躍遷；

電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（

S0

→

T1禁阻躍遷）43

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光磷光分析儀器應(yīng)用熒光分析法的應(yīng)用示例(1)無(wú)機(jī)化合物的分析在紫外光照射下會(huì)發(fā)生熒光的無(wú)機(jī)化合物很少，主要依賴(lài)于有機(jī)試劑形成的螯合物。直接熒光測(cè)定法其中，較常測(cè)定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測(cè)定的靈敏度有些可以達(dá)到10-10;某些元素雖然不與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會(huì)與發(fā)熒光的配合物爭(zhēng)奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強(qiáng)度此該元素的含量。較常測(cè)定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W熒光熄滅測(cè)定法

自從1867年Goppelsroder進(jìn)行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁—桑色素配合物的熒光進(jìn)行鋁的測(cè)定以來(lái)，采用有機(jī)試劑可以測(cè)定70多種元素。催化熒光測(cè)定法較常測(cè)定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某些元素雖然與有機(jī)試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是反應(yīng)速度慢，在某些微量元素的催化下，反應(yīng)速度會(huì)加快，在特定的時(shí)間內(nèi)可用來(lái)測(cè)定微量元素。低溫?zé)晒鉁y(cè)定法常測(cè)定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN溶液溫度的降低，顯著增強(qiáng)溶液的熒光強(qiáng)度。液氮－1960C較常測(cè)定的元素有：Ce、Sm、Tb等稀土元素

Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn固體熒光測(cè)定法固體熒光法在熒光分析中也經(jīng)常用到。(2)生物與有機(jī)化合物的分析熒光分光光度法的應(yīng)用實(shí)例：尿液中維生素B2的測(cè)定：

維生素B2(核黃素)在430nm~440nm藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)生綠色熒光，λem=535nm。在pH=6~7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH=11時(shí)熒光消失；

但在堿性溶液中經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnO4氧化下會(huì)生