液相色譜-故障分析和維護(hù)

液相色譜實(shí)用技術(shù)（一）使用注意事項(xiàng)及故障分析采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小流動相的選擇液相色譜柱對流動相的要求液相色譜對流動相的要求除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長等等水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率流動相的選擇水/MeOH梯度ODS柱鬼峰GradientCurve鬼峰的出現(xiàn)流動相的選擇溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2μm的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫流動相的選擇甲醇乙睛正己烷分析純級和HPLC級溶劑的吸光度比較圖流動相的選擇濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和

有機(jī)溶劑溶劑的過濾流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰柱中氣泡使流動相繞流，峰變形基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡檢測器氣泡脫氣的目的防止由溶解（在液體中的）氣體量的變動引起的檢測信號不穩(wěn)定

1）示差折射率檢測器：*使折射率變化

2）UV檢測器（200nm以下）：*溶解氧氣有吸收

3）熒光檢測器：*溶解氧氣有消光作用流動相脫氣的方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)（氟樹脂膜的減壓脫氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品處理使用流動相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時尤為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀· 裝置：

高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。梯度洗脫法優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度梯度洗脫法的注意點(diǎn)溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。緩沖液

選擇緩沖液的步驟

1.確定最佳分離狀態(tài)時的流動相pH2.選擇具有與流動相的pH相近的pKa的緩沖液

（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）3.確認(rèn)檢測波長下緩沖液是否有大的吸收

（在波長210nm附近進(jìn)行檢測時，

不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）緩沖液的使用

使用前必須過濾

使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞分離的簡單原則出得來；分得開；盡量快。液相色譜常見問題

不要總是首先埋怨色譜柱!!!常見問題及其對策液相色譜常見問題類型

A.壓力異常（偏高、波動）B.漏液C.保留時間漂移D.基線問題（漂移、噪聲）E.峰形異?，F(xiàn)象：無壓力，流動相不流動可能原因

1、保險(xiǎn)絲斷或電源問題

2、柱塞桿折斷

3、泵頭內(nèi)有空氣或流動相不足

4、單向閥損壞

5、漏液

6、壓力傳感器損壞(流動相流動正常，但無壓力)壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏高或不斷上升

1、流速設(shè)定過高

2、保護(hù)柱或柱子篩板堵塞

3、流動相使用不當(dāng)或有緩沖鹽析出

4、色譜柱選擇不當(dāng)

5、進(jìn)樣閥損壞

6、線路過濾器堵塞壓力異?，F(xiàn)象：壓力持續(xù)偏低

1、流速設(shè)定過低

2、色譜柱選擇不當(dāng)

3、柱溫過高

4、系統(tǒng)漏液壓力異常壓力異常現(xiàn)象：壓力波動可能原因泵頭中有氣泡單向閥損壞柱塞密封圈損壞脫氣不充分系統(tǒng)漏液使用了梯度洗脫漏液接頭處漏液

1、接頭處松動

2、接頭磨損

3、接頭被污染

4、部件不匹配

漏液泵漏液

1、單向閥松動

2、泵密封損壞

3、放空閥損壞

4、接頭松動（不要擰的太緊）檢測器漏液可能原因

1、流通池墊片損壞

2、流通池透鏡破碎

3、手緊接頭處漏液

4、進(jìn)樣針尺寸不合適

5、廢液管堵塞

6、流通池堵塞漏液

可能原因

1、柱溫變化

2、流動相組分變化

3、色譜柱沒有平衡

4、流速變化

5、泵中有氣泡

6、流動相選擇不當(dāng)

7、鍵合相流失

8、緩沖容量不夠保留時間漂移基線漂移可能原因

1、溫度波動

2、流動相不均勻(脫氣，使用純度更高的溶劑)3、流通池被污染或有氣泡

4、流通池窗口破裂

5、流動相配比不當(dāng)或流速變化

6、柱子平衡（約30－60min）基線問題基線漂移可能原因

7、流動相污染，變質(zhì)或由低品質(zhì)溶劑配成

8、樣品中有強(qiáng)保留的物質(zhì)以饅頭樣峰被洗出

9、檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處基線問題基線噪聲（規(guī)則的）可能原因

1、流動相、泵、檢測器中有氣泡

2、有地方漏液

3、流動相混和不均勻

4、溫度影響（檢測器和柱溫差別太大）

5、其他電子設(shè)備的影響基線問題基線噪聲（不規(guī)則的）可能原因

1、流動相污染、變質(zhì)或由低質(zhì)溶劑配成

2、有地方漏液

3、流動相各溶劑不相溶或混和不均勻

4、流通池污染

5、檢測池能量不足

6、系統(tǒng)內(nèi)有氣泡基線問題色譜峰分裂柱外死體積柱頭填料污染部分阻塞進(jìn)樣閥密封問題化合物一起洗脫色譜峰展寬所有的色譜峰展寬柱效降低進(jìn)樣體積太大部分色譜峰展寬上次進(jìn)樣洗脫的色譜峰蛋白或聚合物等高分子量化合物色譜峰拖尾部分色譜峰拖尾次級保留效應(yīng)–

殘留硅醇基的作用在大峰的尾部有小峰所有色譜峰拖尾柱外效應(yīng)柱頭污染重金屬離子色譜柱填充不理想前伸峰色譜柱沒有充分平衡在主峰前有小色譜峰負(fù)峰檢測器輸出信號的極性相反樣品的吸收小于流動相，流動相不純樣品溶劑干擾示差折光檢測器中樣品的折射率較低進(jìn)樣中帶入氣泡

可能原因

1、樣品過載

2、樣品溶劑選擇不當(dāng)變形峰鬼峰1、進(jìn)樣閥殘余峰2、樣品中未知物3、柱未平衡4、水污染5、三氟乙酸氧化液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）色譜柱的使用及保養(yǎng)1.柱頭螺絲2.過濾篩板3.色譜柱管刃環(huán)4.柱頭壓帽5.色譜柱柱管

色譜柱結(jié)構(gòu)

3微米多孔二氧化硅微球固定相基質(zhì)類型Si-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-HSi-O-H硅膠顆粒表面硅羥基鍵合相Si-O-HSi-O-SiSi-O-Si-O-SiSi-O-Si液相色譜固定相烷基鍵合固定相表面良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時，先仔細(xì)閱讀說明書測定柱效（說明書+實(shí)際條件）保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件定期檢測柱效定期檢測儀器的譜帶展寬色譜柱的使用及操作流動相的轉(zhuǎn)換流速（壓力）的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求色譜柱的保養(yǎng)（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用色譜柱的保養(yǎng)（二）流動相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線過濾器In-LineFilter，部件號WAT084560防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效的分析時中常用（如：氨基酸分析）在色譜柱類型特殊時使用可更換的消耗品更換濾芯，部件號WAT005139(5/pkgs)更換墊圈，部件號WAT084567(10/pkgs)保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個色譜柱的柱效，特別是在用微柱時保護(hù)柱的種類普通自裝填料的保護(hù)柱Waters的部件號，WAT084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters的部件號，WAT088141有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低可換芯式保護(hù)柱新型的保護(hù)柱—SentryGuard適應(yīng)的用戶類型非常臟,非常復(fù)雜的樣品本底生化樣品,溶液環(huán)境樣品食品不想做太多的固相萃取不想降低柱效新型的保護(hù)柱—SentryGuardSentryGuard的特點(diǎn)特點(diǎn)高質(zhì)量,高效填料-不損失柱效增加分析柱效-增加適應(yīng)范圍20mm柱長-臟樣品載荷能力大，能延長保護(hù)柱壽命手可擰緊接頭，安裝時不需要工具通用柱套-適用于所有的HPLC柱(3.9及4.6內(nèi)徑)整體式（對Waters柱）-使用方便，容易各種不同填料配合Waters柱SentryGuard的規(guī)格產(chǎn)品描述3.920mm柱長適應(yīng)任何色譜柱，不需工具即可安裝及更換可換柱芯式設(shè)計(jì)，提供各種填料:BondaPak: C18,phenyl,CN,NH2,SilicaNova-Pak: C18,C8,phenyl,CN,SilicaResolve: C18,C8,SilicaDelta-Pak: C18,C4Symmetry: C18,C8色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽等等合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度色譜柱儲存固定相儲存溶劑反相(C18,C8,C4,etc.)甲醇或乙腈Phenyl甲醇或乙腈

CN(反相)乙腈CN(正相)

3:97Heptane:IPA

NH2,Diol,Silica

3:97Heptane:IPA

色譜柱常見毛病柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異不同溫度有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低柱壓過高

為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機(jī)械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強(qiáng)或流動相過弱非特異性吸附色譜柱以外的因素（一）“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！儀器問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大色譜柱與儀器的聯(lián)接除HP外，不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時，會造成：色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從PhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。Waters色譜柱的聯(lián)接Waters及PhaseSeparations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長度不同，其長度被稱為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長度為0.130英寸Spherisorb品牌的色譜柱及PhaseSeparations公司其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth為0.090英寸HPLC常用的色譜柱接頭TroubleshootingLCFittings,PartII.J.W.DolanandP.Upchurch.LC/GCMagazine6:788(1988)0.09in.=2.33mmSwagelok安捷倫1100液相ParkerValcoUptight0.09in.=2.33mm0.08in.=2.07mm0.09in.=2.33mm0.13in.=3.37mm0.17in.=4.40mmWatersRheodyne不同的Stop-Depth長度<0.12mm內(nèi)徑管線用于毛細(xì)管HPLC中<2.1內(nèi)徑色譜柱0.17mm內(nèi)徑管線用于分析型HPLC中2.1~4.6內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑管線用于半制備型HPLC中9.4內(nèi)徑色譜柱0.5mm內(nèi)徑管線用于制備型HPLC中2