放射性自顯影技術(shù)

第四章放射性自顯影技術(shù)第一節(jié)原理和一般制作程序第二節(jié)放射自顯影的制作方法第三節(jié)與自顯影質(zhì)量有關(guān)的幾個因素第四節(jié)放射性自顯影技術(shù)的應(yīng)用第一節(jié)原理和一般制作程序

一、放射性自顯影的原理和特點

放射性自顯影

利用照相乳膠記錄、檢查和測量樣品中放射性核素的分布、定位和定量的方法。

放射性自顯影的特點（1）準確定位；（2）靈敏度高；（3）能保持機體的完整結(jié)構(gòu)；（4）可以長期保存；（5）操作簡便，不需要復雜的儀器和設(shè)備。

局限性：

定量誤差大，只作相對定量；測定的速度較慢。（一）自顯影標本的制備（二）曝光（三）顯影（四）定影（五）水洗及干燥二、放射性自顯影的一般制作程序1.洗凈；2.吸水紙吸干；3.平鋪于標本夾；4.干燥。（一）自顯影標本的制備

曝光

:把照相乳膠曝露于射線而產(chǎn)生潛影。

1.感光材料的選擇:

由溴化銀和明膠組成。明膠是溴化銀的支持劑，又是溴原子的吸收劑；它決定著乳膠的通透性、吸水膨脹、濃度稀釋和堅膜作用等特性。而乳膠的敏感度決定于溴化銀的濃度、顆粒大小及其配制方法。（二）曝光

乳膠名稱鹵化銀晶體直徑（μm）鹵化銀

(%)晶體粒子數(shù)/1000μm3靈敏度分辨力產(chǎn)品特點適用范圍幻燈片電影膠片~110~156差中乳膠層約15μm涂于片基的一面宏觀或光學顯微自顯影X射線乳膠片0.2~310~206高差乳膠層約30μm涂于片基的兩面宏觀自顯影核乳膠0.02~0.54510000高高液體、干板、脫基膜光學顯微及電鏡自顯影幾種自顯影感光材料的性能

（1）在有效期內(nèi)使用。（2）周圍不能有放射性物質(zhì)。（3）X射線乳膠片和幻燈片應(yīng)注意避光、防潮、防熱，最好在恒溫恒濕房間（15~20oC）保存；（4）液體核乳膠應(yīng)置于棕色玻璃瓶中，外用黑紙包好，再用塑料袋包好，保存于4oC冰箱內(nèi)。感光材料的保存：

2.曝光（1）潛影的形成

將溴化銀的晶體點陳制作成有缺陷的，這些缺陷構(gòu)成潛影過程中的敏化中心。

當核射線、光線、熱、壓力等作用于溴化銀時，溴化銀中的電子便向敏化中心移動，形成帶負電荷的靜電層，然后正電荷的銀離子便向靜電層聚集而變成銀原子，形成潛影。--------++++1234潛影的形成

（2）曝光時間

a)以公式計算曝光時間：

設(shè)L為單位面積上衰變了的放射性活度；

A0為單位面積上開始時的放射性活度；

At為單位面積上曝光結(jié)束時的放射性活度。由L=A0–At；At=A0e-λt

得：

t=LnT0.693A0A0-L

b）經(jīng)驗估計

要使X乳膠產(chǎn)生適宜的黑度，大約需要500～1000萬β粒子或100～200萬α粒子/cm2。對于β粒子來說：

N/At

c）實驗曝光法×曝光時間=（0.5~1）×107

粒子/cm2

顯影

指感光后形成潛影的乳膠，在顯影劑的作用下，使?jié)撚稗D(zhuǎn)化為金屬銀的過程。

（1）顯影液的組成：顯影劑：常用米吐爾，主要起還原作用。

促進劑：常用碳酸鈉，維持堿性條件。

保護劑：常用亞硫酸鈉，中和氧化產(chǎn)物。

抑制劑：常用溴化鉀，抑制未感光的銀鹽。

（三）顯影（2）顯影條件

配制好的顯影液應(yīng)盛于帶蓋的深色玻璃瓶中，置于陰涼處或冰箱中。在溫度為18～20oC的條件下，顯影時間約為5～6分鐘。

定影

定影劑硫代硫酸鈉和溴化銀作用，將溴化銀溶解，從而使未感光的銀鹽從乳膠中溶去而成為透明膜。

其反應(yīng)式如下：

AgBr+Na2S2O3

?NaAgS2O3+NaBr

NaAgS2O3

?Na++[AgS2O3]-

NaAgS2O3+Na2S2O3

?

Na3Ag(S2O3)2（四）定影

（1）定影劑：硫代硫酸鈉，遇酸易分解。（2）保護劑：常用亞硫酸鈉，抑制定影劑的遇酸分解。（3）停顯劑：常用醋酸、硼酸，中止顯影。（4）堅膜劑：常用明釩、鉻釩。2.定影液的組成

3.定影條件

溫度以19~20oC為宜，定影時間約為10~15分鐘。

（五）水洗及干燥

定影后要經(jīng)充分水洗，以清除殘余的定影劑和未被顯影的銀鹽。一般要求在流水中沖洗20~30分鐘，然后在空氣中晾干。第二節(jié)放射性自顯影的制作方法

一、宏觀放射性自顯影的制作方法

（一）整體植株的放射性自顯影（二）放射性紙層析和薄層層析板自顯影（三）土壤整段標本的放射性自顯影（四）觀察

二、光學顯微自顯影

(一)方法

1.接觸法

將試驗樣品制成石蠟切片，用蛋白甘油將石蠟切片貼在載片上，可先染或曝光后染色，干燥后在暗室中將乳膠面對切片，緊密接觸，進行曝光。

2.液體乳膠法

在暗室安全燈下，將所需的乳膠稱出，使其裝入燒杯中，置于40oC水浴溶解。然后采用滴涂或浸蘸法將乳膠直接加在載玻片上，并使均勻地鋪開。涼干后連同標本一起進行曝光。

具體又可分為：涂布法和浸蘸法。涂布法和浸蘸法示意圖

（二）染色

1.前染

是指涂核乳膠前對切片進行染色。優(yōu)點：乳膠層不被染色，與后染相比顏色清晰鮮明。缺點：染色處理可能引起標本中放射性的損失；對易溶性放射性化合物不宜采用前染。

2.后染

是指在切片涂布核乳膠、曝光、顯影、定影后進行的染色。

優(yōu)點：沒有前染的放射性損失問題；

缺點：在染色過程中可能會使顯影銀粒消失，乳膠脫落。

1.粒子計數(shù)法

在一定面積上或一定細胞器上的顯影銀顆粒的多少確定樣品中的放射性高低。

2.徑跡計數(shù)

根據(jù)較厚乳膠層中產(chǎn)生的徑跡數(shù)，來測定放射性。

3.光密度測定：用顯微光度計（三）光學顯微自顯影的觀察與分析第三節(jié)與自顯影質(zhì)量有關(guān)的

幾個因素一、各種粒子在乳膠中的徑跡α粒子：徑跡直，密度均勻，圖像最好。β粒子：徑跡彎彎曲曲，射程因能量而異。γ粒子：一般在乳膠中不留什么痕跡。

分辨力

用銀粒密度最大的點與其密度減少到一半的點之間的距離（HD）來表示。

影響分辨力的因素：

（1）溴化銀顆粒的大?。?）乳膠厚度（3）標本厚度(4)標本與乳膠層的距離（5）射線的能量：3H、14C、32P

（6）曝光和顯影時間二、分辨力

自顯影效率

指一個入射粒子所生成顯影顆粒數(shù)目。其受下列因素影響：

（1）射線能量（2）標本的厚度（3）乳膠層的厚度：小于射程時（4）溴化銀結(jié)晶的大?。盒《軙r（5）乳膠的靈敏度（6）乳膠層與標本的距離（7）曝光時間三、自顯影效率

在制備自顯影的過程中，由于非標本放射源而引起乳膠顯影的均稱本底。

造成自顯影本底的原因有：

（1）曝光：紅燈過亮（2）過度顯影（3）化學假象（4）壓力和張力（5）環(huán)境輻射和天然本底四、自顯影的本底第四節(jié)放射自顯影技術(shù)的應(yīng)用一、遺傳育種研究二、土壤中養(yǎng)分移動研究三、植物營養(yǎng)運轉(zhuǎn)研究四、植物保護研究五、農(nóng)藥殘留及環(huán)境保護研究

顯微放射性自顯影與核酸分子雜交及細胞學技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了原位分子雜交技術(shù)。即將完整的細胞核染色體，做成細胞學片子，使其中的DNA固定在載玻片上，并保持它們原來的細胞學位置，進行解鏈處理后，與用同位素標記的和它互補的RNA或單鏈的DNA溶液雜交，然后進行自顯影，可以從中觀察到雜交分子在染色上所占的位置。

為了研究不同營養(yǎng)元素在植物中的循環(huán)形式，Biddulph等向紅菜豆水培液中施入32P、35S和45Ca，吸收1小時后轉(zhuǎn)入非標記的營養(yǎng)液中。然后按一定時間間隔進行自顯影。證明在整個96小時的實驗期間，有一部分磷仍在繼續(xù)運轉(zhuǎn)，硫在開始時是活動的，但當它進入幼葉后，活動性就停止了。鈣卻不同，當它被蒸騰流帶入葉子后，就保持在葉中，全不流動。

從植物對寄生物的影響來看，植物中的放射性物質(zhì)可以進入寄居其上的病菌或害蟲。但病菌通過什么組織？在什么時候開始吸收寄主中的養(yǎng)料？用3H-標記的堿基和14C-乳清酸標記寄主后，用非標記的銹病夏孢子接種，證明在吸器形成后才開始吸收，這時寄主中的標記物，通過吸器鞘進入吸器和菌絲體。

浙江農(nóng)科院和上海原子核研究所對除草丹的研究證明，稗草吸收14C-除草丹的能力比水稻高1-2倍，它主要積累于稗草的葉鞘和莖基中，抑制了葉鞘的生長，造成基部腫疽，最后缺抑制生長，饑餓而死。除草丹抑制了稗草根系對養(yǎng)分的吸收能力和向地上部器官的運轉(zhuǎn)。施藥和不施藥的相比，其根系吸收32P量相差50%，往地上部運輸?shù)?2P量相差一倍多，但對水稻的影響較小。課后作業(yè)

假設(shè)對32P標記的某植物葉片進行放射自顯影