第三章發(fā)酵液的預(yù)處理與菌體的回收

第三章發(fā)酵液的預(yù)處理

和菌體的回收1預(yù)處理和固液分離內(nèi)容固液分離發(fā)酵液胞外上清液/濾液預(yù)處理提取生化物質(zhì)的第一步，分兩部分：胞內(nèi)富集細胞2發(fā)酵液成分很復(fù)雜，包含菌（細胞）體，胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物，及剩余的培養(yǎng)基殘分等。不管人們所需要的產(chǎn)物是胞內(nèi)還是胞外，都首先要進行培養(yǎng)液的預(yù)處理和固液分離開，才能進行后續(xù)操作：對于胞外產(chǎn)物，可先將菌體或其他懸浮雜質(zhì)去處，才能從澄清的濾液中提取代謝產(chǎn)物。對于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先富集菌體，再進行細胞破碎和碎片分離，然后提取胞內(nèi)產(chǎn)物。3主要內(nèi)容懸浮液的基本特性懸浮液的預(yù)處理懸浮液分離過程和分類過濾法過濾的理論基礎(chǔ)過濾器的類型過濾器的選擇錯流過濾41懸浮液的基本特性懸浮液固體顆粒在10-5cm以上的固液分散體系生物細胞培養(yǎng)液液相,大部分為水；固相,生物體細胞；發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%;懸浮物顆粒小，細胞的相對密度與培養(yǎng)液相似;可壓縮性;液相粘度大，大多為非牛頓型流體；懸浮狀態(tài)穩(wěn)定：雙電層、水化膜、布朗運動5為何要對發(fā)酵液進行預(yù)處理？固液分離方法主要是過濾和離心。對于細菌及某些放線菌，菌體細小，液體粘度大，不能直接過濾;若用高速離心，能耗很大，設(shè)備昂貴;若用膜分離技術(shù)(如微濾)易產(chǎn)生膜污染，通量降低。發(fā)酵液中由于菌體自溶，核酸、蛋白質(zhì)及其它有機粘性物質(zhì)的存在也會影響固液分離。62懸浮液的預(yù)處理預(yù)處理的目的

促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離的效率改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，包括增大懸浮液中固體粒子的尺寸，降低液體黏度等；盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中（多數(shù)為液相）；相對純化，去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)（高價無機離子和雜蛋白質(zhì)），便于后續(xù)各部操作；72.懸浮液的預(yù)處理

具體方法加熱法；調(diào)節(jié)懸浮液的pH值；凝聚和絮凝；使用惰性助濾劑；82.1加熱法把懸浮液加熱到所需溫度并保溫適當(dāng)時間。加熱是發(fā)酵液預(yù)處理最簡單最常用的方法，加熱能改善發(fā)酵液的操作特性，也可以進行滅菌。適用性：熱穩(wěn)定性的產(chǎn)物。注意加熱溫度與時間，不影響產(chǎn)物活性和細胞的完整性。92.1加熱法1）加熱降低液體粘度液體黏度是溫度的指數(shù)函數(shù)，升溫是降低黏度的有效措施。流體力學(xué)原理過濾速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。麥芽汁的黏度-溫度曲線。102.1加熱法2）加熱使蛋白質(zhì)變性凝固變性蛋白質(zhì)的溶解度小。如檸檬酸發(fā)酵液加熱至80℃以上，可使蛋白質(zhì)變性凝固，過濾速度加快。112.2調(diào)節(jié)懸浮液的pH值pH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。如利用酸堿性來調(diào)節(jié)pH值使蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)達到等電點得以除去。又如過濾中，發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)易與膜發(fā)生吸附，通過調(diào)整pH值改變易吸附分子的電荷性質(zhì)，即可減少堵塞和污染。草酸、無機酸或堿122.3凝聚和絮凝均為懸浮液預(yù)處理的重要方法，適用于菌體細小而且粘度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。。處理過程：是將化學(xué)藥劑預(yù)先投加到懸浮液中，改變細胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進行分離。特點可使顆粒尺寸有效增加增大顆粒的沉降或浮選速率提高濾餅的滲透性或在深床過濾時產(chǎn)生較好的顆粒保留作用。132.3凝聚和絮凝概念凝聚指在投加的化學(xué)物質(zhì)作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成1mm大小塊狀凝聚體的過程。絮凝指使用絮凝劑將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚劑的作用機理初始粒子表面電荷的簡單中和；消除雙電荷層而脫穩(wěn)；破壞水化膜；通過氫鍵或其它復(fù)雜的形式與粒子相結(jié)合而產(chǎn)生凝聚。絮凝劑的作用機理架橋作用價格較昂貴14發(fā)酵液中菌體表面帶有負電荷，由于靜電引力使溶液中反離子被吸附在其周圍，在界面上形成了雙電層。正離子同時受到使它們均勻分布的熱運動影響，具有離開膠粒表面的趨勢。膠體雙電層結(jié)構(gòu)15高分子絮凝劑的吸附架橋作用162.3凝聚和絮凝常用凝聚劑無機類電解質(zhì)多為陽離子型無機鹽類

硫酸鋁、明礬、硫酸鐵和硫酸亞鐵、三氯化鐵、氯化鋅、硫酸鋅、硫酸鎂等金屬氧化物類

氫氧化鋁、氫氧化鐵、氫氧化鈣或石灰等聚合無機鹽類

聚合鋁、聚合鐵等常用絮凝劑聚丙烯酰胺經(jīng)不同改性可成為下述三種類型之一；微生物絮凝劑陰離子型聚丙烯酸納、聚苯乙烯磺酸陽離子型聚丙烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺鹽非離子型聚氧化乙烯172.4使用惰性助濾劑惰性助濾劑是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅硬、不可壓縮的粒狀物質(zhì)，用于擴大過濾表面的適用范圍，使非常稀薄或非常細小的懸浮液在過濾時發(fā)生的快速擠壓和介質(zhì)堵塞現(xiàn)象得到減輕，易于過濾。在發(fā)酵液中加入固體助濾劑，則菌體可吸附于助濾劑微粒上，助濾劑就作為膠體粒子的載體，均勻地分布于濾餅層中，降低了濾餅的可壓縮性，減小了過濾阻力。使用方法：在濾布上預(yù)涂一層助濾劑，作為過濾介質(zhì)使用，待濾畢后與濾餅一起除去；助濾劑按一定比例混入待濾的懸浮液中，然后一起進入過濾機，使其形成較松的濾餅，降低其可壓縮性，讓濾液可順暢通過。材料：如硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣或這些材料的混合物。182.5雜蛋白的其它去除方法等電點沉淀變性吸附沉淀192.6高價無機離子的去除方法加酸鈣離子草酸鎂離子三聚磷酸鈉鐵離子黃血鹽203懸浮液分離過程和分類213.1過濾法(Filtration)過濾是指以某種多孔物質(zhì)作為介質(zhì)，在外力(壓力差ΔP)的作用下，流體通過介質(zhì)的孔道，而使固體顆粒被截留下來，從而實現(xiàn)固體顆粒與流體分離目的的操作。過濾可去除氣固體中的固體顆粒，也可去除液固體中的固體顆粒。對于好的定形的晶體，這是一種最直接的步驟。22過濾filtration過濾介質(zhì)filtermedium

:過濾采用的多孔物質(zhì)；濾漿filterpulp

:所處理的懸浮液；濾液filtrate

:通過多孔通道的液體；濾餅或濾渣filtercake:被截留的固體物質(zhì)。23工業(yè)過濾方式:深層過濾、濾餅過濾

特點：固體顆粒的沉積發(fā)生在較厚的粒狀過濾介質(zhì)內(nèi)部，過濾介質(zhì)表面上無顆粒層形成。特點：固體顆粒呈餅層狀沉積于過濾介質(zhì)的上游一側(cè)，形成濾餅層。適用：處理顆粒含量較高的懸浮液（>0.1%）適用：懸浮液中顆粒尺寸甚小而且含量甚微的場合。(<0.1%)懸浮液過濾介質(zhì)濾液深層過濾清液過濾介質(zhì)懸浮液濾餅濾餅過濾24濾餅過濾中

流體→濾餅層(固定床)+過濾介質(zhì)

過濾后期，濾餅為主要的“過濾介質(zhì)”。25過濾介質(zhì)原理上能截留懸浮液的固體顆粒，而液體可以自由通過的多孔介質(zhì)，如

織物介質(zhì)布或金屬織物，此類介質(zhì)可截留5-65μm的顆粒。

堆積層固體介質(zhì)堆積成的過濾層，多用于深層過濾。固體多孔介質(zhì)多孔無機材料(多孔陶瓷)和多孔高分子材料(多孔膜)。26過濾介質(zhì)-粒狀介質(zhì)有硅藻土、珍珠巖粉、細砂、活性炭、白土等。最常用的是硅藻土，是優(yōu)良的過濾介質(zhì)：①一般不與酸堿反應(yīng)，化學(xué)性能穩(wěn)定；②形狀不規(guī)則，空隙大且多孔，具有很大的吸附表面；③無毒且不可壓縮，形成的過濾層阻力不隨操作壓力變化。硅藻土過濾介質(zhì)通常有三種用法：（1）作為深層過濾介質(zhì)。硅藻土過濾層具有曲折的毛細孔道，借篩分、吸附和深層效應(yīng)作用除去懸浮液中的固體粒子，截留效果可達到1μm。（2）作為預(yù)涂層。在支持介質(zhì)的表面上預(yù)先形成一層較薄的硅藻土預(yù)涂層，用以保護支持介質(zhì)的毛細孔道不被濾餅層中的固體粒子堵塞。（3）用作助濾劑。27但對微小而形狀多變的微生物細胞，發(fā)酵液和其它生物溶液的過濾就變得復(fù)雜了。一般，由于料液通常都是高的非牛頓粘度流體或者是高度可壓縮濾餅，發(fā)酵液和其它生物溶液是極其難以過濾的，也就是說，我們必須對這些生物分離程序進行修改，即必須經(jīng)過預(yù)處理。283.2濾的理論基礎(chǔ)過濾基本方程式

293.2過濾的理論基礎(chǔ)由于過濾的快慢與多孔介質(zhì)的孔隙、顆粒的結(jié)構(gòu)特征等有關(guān)，因此先了解相關(guān)的物理量?？紫堵师诺亩x(2-1)比表面a的定義(2-2)當(dāng)量直徑de

(2-3)303.2過濾的理論基礎(chǔ)因此，它與孔隙率、比表面積之間的關(guān)系可表示為(2-4)Kozeny在考察液體通過多孔介質(zhì)時，認為孔隙空間相當(dāng)于一束毛細管，而且有共同的當(dāng)量直徑。后來Carman利用流體穿過毛細管的poiseuille定律建立了濾速與孔隙率、比表面等物理量之間的關(guān)系。313.2過濾的理論基礎(chǔ)根據(jù)poiseuille定律在不規(guī)則孔道中使用poiseuille定律時，管道流速u要換成孔道流速u′，管道直徑換成孔道的當(dāng)量直徑de，即(2-5)323.2過濾的理論基礎(chǔ)將當(dāng)量直徑式(2-4)與孔隙率、比表面之間的關(guān)系代入式(2-5)得(2-6)根據(jù)孔隙率的定義，孔道流速u′與管道流速u之間的關(guān)系可表示為u′=u/ε，所以，過濾基本方程可表示為(2-7)333.2過濾的理論基礎(chǔ)常數(shù)K由實驗測定，通常取5對于單位面積、單位時間通過過濾介質(zhì)的濾液量稱為過濾速率，(2-8)若令r稱為比阻，因此比阻是與孔道、顆粒特性有關(guān)的物理量。343.2過濾的理論基礎(chǔ)代入比阻后，過濾速率方程表示為

(2-9)對于濾餅過濾，此式仍未考慮過濾介質(zhì)的影響，設(shè)過濾介質(zhì)厚度為Le，因此總的壓強差Δp是由于流體通過厚為L的濾層和厚度為Le的過濾介質(zhì)所引起的壓強損失。準確的速率方程為(2-10)353.2過濾的理論基礎(chǔ)要積分方程式(2-10),就要建立壓強、濾層厚度與濾液體積之間的關(guān)系。1、濾層厚度與濾液體積之間的關(guān)系當(dāng)懸浮液進入過濾機時，由于過濾介質(zhì)的篩分作用使懸浮液分開成兩部分——濾餅和濾液V。設(shè)所獲得濾餅體積與濾液體積之比為v，截面為A。則有(2-11)363.2過濾的理論基礎(chǔ)厚度為Le的介質(zhì)，也虛擬一個體積Ve，仿照上式有(2-12)將兩式代入過濾基本方程式(2-9)得

(2-13)對于不同的操作條件下積分上式即得到不同的結(jié)果。2、壓強與濾液體積之間的關(guān)系在過濾操作中，通常有兩種操作方式：等速操作和恒壓操作。373.2過濾的理論基礎(chǔ)等速操作維持過濾速率在恒定條件下進行(2-14)在實際的過濾過程中，要保持過濾過程的速率恒定，從式(2-14)可見，隨著濾液的改變，必須不斷的改變壓差。這樣使過濾過程的操作復(fù)雜化，實際上過濾過程很少使用等速操作。但在過濾初期的一小段時間可能處于恒速操作。383.2過濾的理論基礎(chǔ)恒壓操作在過濾過程中壓強不改變。假定濾餅不可壓縮，操作過程溫度不變，則式(2-13)可積分。移項后得邊界條件θ=0，V=0；θ=θ，V=V。移項整理并積分得

因此(2-15)393.2過濾的理論基礎(chǔ)恒壓操作令k=1/rvμ，是一個與顆粒、濾層結(jié)構(gòu)、懸浮液濃度和溫度有關(guān)的量。再令K=2kΔp，因此恒壓過濾時的過濾方程為(2-16)定義單位面積的濾液量q，即403.2過濾的理論基礎(chǔ)恒壓操作所以恒壓過濾時的過濾方程又可以改寫為(2-17)當(dāng)過濾介質(zhì)阻力可忽略時，恒壓過濾時的過濾方程可簡化為(2-18)如果可壓縮濾餅，比阻隨壓強而變，其影響可在壓強項加一指數(shù)校正。41問題用壓濾機分離懸浮物，忽略過濾介質(zhì)阻力，濾餅不可壓縮。過濾時間增加一倍，濾液量增加()；過濾面積增加一倍，濾液量增加()；過濾壓強增加一倍，濾液量增加()。用壓濾機分離懸浮物，忽略過濾介質(zhì)阻力，濾餅不可壓縮，其他條件不變。提高懸浮液溫度，單位過濾時間所得濾液量將()；提高懸浮液的固體含量，單位過濾時間所得濾液量將()；42例題用過濾面積為0.04m2的小型板框壓濾機恒壓過濾含固體10%（質(zhì)）的濾漿，濾餅不可壓縮，濾餅含水量20%。過濾時間分別為0，38.2，114.4秒時的濾液量分別為0，0.04，0.008m3。若在相同條件下處理濾漿10t/h。需要多大的過濾面積？濾液密度為1000kg/m3。43例題解：V2+2VVe=KA2θ

將已知條件代入解得K=5.26×10-4m2/sVe=20.18×10-4m310噸懸浮液中含液體：10×1000（1-0.1）/1000=9m39m3的液體有一部分滯留在濾餅中，并設(shè)滯留在濾餅中的x噸44例題x/(10*0.1+x)=0.2計算得X=0.250噸=0.25m3

因此，濾液量V為V=9-0.25=8.75m3將恒壓過濾方程V2+2VVe=KA2θ;45洗滌目的：回收滯留在顆粒縫隙間的濾液；凈化構(gòu)成濾餅的顆粒方法：恒壓洗滌，壓差為過濾的最終壓差；特點：洗滌速率恒定（濾餅厚度不變，阻力恒定）計算的內(nèi)容：使用一定量洗滌液時所需要的洗滌時間。46典型過濾設(shè)備：按操作方式分類：間歇過濾機、連續(xù)過濾機按操作壓強差分類：壓濾、吸濾和離心過濾實驗室用抽濾裝置板框壓濾機（間歇操作）轉(zhuǎn)筒真空過濾機（連續(xù)操作）過濾式離心機3.3過濾器的類型471）實驗室用抽濾裝置482）板框壓濾機

plateandframefilter

板框壓濾機的過濾推動力來自泵產(chǎn)生的液壓或進料貯槽中的氣壓。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細菌等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。

49板框式壓濾機排列方式：板、框交替，個數(shù)可調(diào)。

操作周期：組裝→過濾→洗滌→卸渣→整理。

操作方式：間歇操作50板框壓濾機包括板和框，多做成正方形，角端均開有小孔，裝合壓緊后即構(gòu)成供濾漿或洗水流通的孔道?？虻膬蓚?cè)覆以濾布，空框與濾布圍成了容納濾漿及濾餅的空間，濾板用以支撐濾布并提供濾液流出的通道。51板框式壓濾機優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，裝配緊湊，過濾面積大；過濾的推動力(壓力差)能大幅度調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，因而固相含水分低，并能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾；輔助設(shè)備少、維修方便、價格低和動力消耗少等。缺點：設(shè)備笨重、間歇操作、勞動強度大、衛(wèi)生條件差、輔助時間多和生產(chǎn)效率低。523）真空轉(zhuǎn)鼓過濾機

（rotary-drumvacuumfilter）真空過濾設(shè)備以大氣與真空之間的壓力差作為過濾操作的推動力。生物工業(yè)中，用得較多的是轉(zhuǎn)筒式真空過濾機和帶式真空過濾機。轉(zhuǎn)筒真空過濾機的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)筒真空過濾機是一種連續(xù)操作的過濾設(shè)備，設(shè)備的主體是一個由篩板組成能轉(zhuǎn)動的水平圓筒，表面有一層金屬絲網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布,圓筒內(nèi)沿徑向被筋板分隔成若干個空間。533)轉(zhuǎn)鼓真空過濾機54水平帶式真空過濾機帶式真空過濾機（是自動連續(xù)運轉(zhuǎn)、并能按工藝要求進行調(diào)速以及操作方便和動力消耗低的一種新型高效的脫水設(shè)備。優(yōu)點：處理量大，洗滌效果好，無需攪動裝置，操作靈活；缺點：占地面積大，有效過濾面積小，投資較高；55帶式真空過濾機流程1、進料→過濾→濾餅洗滌→吸干→卸料→濾布清洗連續(xù)進行，配有PLC控制，自動化程度高。2、真空過濾盤分段設(shè)計，可滿足不同物料過濾、洗滌、吸干的工藝要求，濾帶運行速度采用變頻無級調(diào)速，對不同物料有廣泛的適應(yīng)性。3、在同一設(shè)備上可采用多次逆流洗滌得到高濃度的濾液，也可采用并流洗滌或順流洗滌獲得高純度的濾餅。56PBF系列連續(xù)水平真空帶式過濾機

PBF系列連續(xù)水平真空帶式過濾機是一種自動化程度高的新型過濾設(shè)備，該機以過濾布或濾網(wǎng)為介質(zhì)，使料漿水平布置于過濾介質(zhì)之上，充分利用料漿重力和真空吸力實現(xiàn)固液分離。連續(xù)水平真空帶式過濾機可適用于多種濃度條件下的物料，過濾效率高，因而被諸多工業(yè)部門優(yōu)先采用。

57轉(zhuǎn)鼓真空過濾機自動化程度高、操作連續(xù)和處理量大適合于固體含量較大(>10％)的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母菌發(fā)酵液或細胞懸浮液的過濾分離。由于受推動力(真空度)的限制，真空轉(zhuǎn)鼓過濾機一般不適于菌體較小和粘度較大的細菌發(fā)酵液的過濾。此外，采用真空轉(zhuǎn)鼓過濾機過濾所得固相的干度不如加壓過濾。58圓盤真空過濾器由槽體、過濾圓盤和分配頭組成；圓盤直徑大，更易實現(xiàn)大型化；59圓盤真空過濾器60硅藻土過濾機diatomitefilter硅藻土中的硅藻有許多不同的形狀，由于硅藻土具有細膩、松散、質(zhì)輕、多孔、吸水和滲透性強的特性，所以它是一種性能優(yōu)良的工業(yè)濾劑。硅藻土過濾是以硅藻土作為過濾介質(zhì)，它是一種預(yù)涂型過濾器，預(yù)涂、過濾、反沖洗是硅藻土過濾的一般工藝過程。在釀造、飲料、酒類和水處理等方面得到廣泛應(yīng)用。目前，國內(nèi)主要用于酒類和飲料過濾

61硅藻62硅藻土過濾機633.4錯流過濾又稱切向流過濾（Cross-FlowFiltration）傳統(tǒng)過濾時過濾液體垂直于過濾介質(zhì)，過濾阻力主要來之濾餅。錯流過濾打破了傳統(tǒng)過濾的機制，即液體的流向和濾膜相切。在壓力推動下，懸浮液以高速在管狀濾膜的內(nèi)壁作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走，而附著在濾膜上的濾餅很薄，因而能在長時間內(nèi)保持穩(wěn)定不變的過濾速度64微濾過程示意圖,料液快速經(jīng)過薄膜,以減少形成濾餅錯流過濾Cross-FlowFiltration65錯流過濾特點收率高（97-98%）質(zhì)量好減少處理步聚染菌罐也能進行處理介質(zhì)阻力大不能得到干濾餅需要大的膜面積目前適用于小分子的分離66Theend674離心分離對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當(dāng)固體顆粒細小而難以過濾時，發(fā)酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。動植物細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離。68離心分離優(yōu)點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：與過濾設(shè)備相比，設(shè)備投資高、能耗大、離心產(chǎn)生的固體濃縮物和過濾產(chǎn)生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體；而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。69離心分離利用慣性離心力和物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的不同而進行的分離、濃縮或提煉操作。分類離心沉降

利用固液兩相的密度差，在離心機無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進行的懸浮液的分離；離心過濾

利用離心力并通過過濾介質(zhì)，在有孔轉(zhuǎn)鼓離心機中分離懸浮液的操作；離心分離和超離心

利用不同溶質(zhì)顆粒在液體中各部分分布的差異，分離不同相對密度液體的操作。704.1原理u=d2/(18μ)(ρs-ρ)ω2rd:粒子直徑；ρs和ρ分別為粒子和流體的密度；μ：流體粘度；u：粒子的運動速度；CD：阻滯系數(shù)；A：粒子在運動方向的投影面積；CD＝f(Re