第四章-基本分子生物學技術

常用分子生物學技術的原理及應用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication目錄第一節(jié)分子雜交與印跡技術第二節(jié)PCR技術的原理與應用第三節(jié)核酸序列分析第四節(jié)基因文庫第五節(jié)生物芯片技術第六節(jié)生物大分子相互作用研究技術第七節(jié)遺傳修飾動物模型的建立及應用（了解）第八節(jié)疾病相關基因的克隆與鑒定（了解）第一節(jié)

分子雜交與印跡技術

MolecularHybridization&BlottingTechnology變性復性具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下，按堿基互補原則形成雙鏈，稱為核酸分子雜交。一、核酸分子雜交概念

DNA-DNA雜交雙鏈分子（一）核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術的原理雜交的雙方分別稱探針和待測核酸。雜交可分為：

DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之間的雜交。雜交具有高度特異性和靈敏性。核酸分子雜交

（一）、DNA的變性在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂。變性的方法（1）熱變性：溫度升高到90―100℃時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（二)、DNA的復性DNA-DNA雜交雙鏈分子變性復性不同來源的DNA分子（二）、DNA的復性

DNA復性的定義在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復性。退火(annealing)

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火。（二）、DNA的復性影響DNA復性的因素1.核酸分子的濃度：適宜的探針濃度。2.核酸分子的長度：核酸探針長度控制在

50～300bp3.溫度：適宜的復性溫度是較Tm值低25℃。4.離子強度：離子強度過低，不利于復性。5.核酸分子的復雜性。（三）探針技術

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料等標記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸。與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。1、核酸探針的種類根據(jù)探針標記方法不同：分為放射性探針和非放射性探針兩大類；根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同：又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針及寡核苷酸探針等；DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。

（1）DNA探針指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針。多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。通過建立基因組DNA文庫；用PCR擴增產(chǎn)物制備探針。優(yōu)點（包括cDNA探針）：①不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。②標記方法較成熟，有多種方法可供選擇。（2）cDNA探針cDNA是指互補于mRNA的DNA分子。通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，克隆于適當?shù)妮d體而使cDNA大量擴增。不含有內(nèi)含子序列。尤其適用于基因表達的檢測。（3）RNA探針RNA探針一般都是單鏈；與靶序列的雜交反應效率極高，比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。（3）RNA探針可用于檢測DNA和mRNA；用RNA探針進行RNA結(jié)構(gòu)分析比用DNA探針效果好；要準確測定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA探針，只能用RNA探針或單鏈DNA探針。存在易于降解和標記方法復雜等缺點。

（4）寡核酸探針

采用化學方法合成的寡核苷酸片段。常用的寡核苷酸探針18～50bp。優(yōu)點：

①可根據(jù)需要合成相應序列；②探針短,序列復雜性低，分子量小，因此雜交時間短;③識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化。④可大量合成，探針價格低廉。

（四）、標記物

（1）理想標記物應具備的特性：高度靈敏性；不影響堿基配對的特異性；不影響探針分子的主要理化性質(zhì)；對酶促反應活性無影響或影響不大；檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性。（四）、標記物常用的探針標記物核素標記物：

3H、32P、35S、125I等。非核素標記物：熒光素、半抗原（地高辛、生物素）、配體等。

（2）、標記方法

體內(nèi)標記法：

將核素標記的化合物作為合成代謝的底物，在細胞合成代謝時使核素摻入到新合成的核酸分子中。例如3H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中。（2）、標記方法體外標記法：化學標記法：標記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應，標記物直接結(jié)合到探針分子上。酶促標記法：標記物預先標記核苷酸，然后利用酶促法將標記的核苷酸摻入到探針上。①硝酸纖維素膜：優(yōu)點是雜交信號本底低，缺點是DNA分子結(jié)合不牢固。②尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強；缺點是雜交信號本底高。③化學活化膜：優(yōu)點是DNA與膜共價結(jié)合；對不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點是結(jié)合能力較上述兩種膜低。用于雜交的3種固相支持體

二、幾種常見雜交技術二、印跡技術的類別及應用（一）DNA印跡技術(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

根據(jù)雜交所用的方法,還可分為斑點(dot)雜交：狹槽(slot)雜交：原位雜交：（一）DNA印跡技術(Southernblotting)

也叫做Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。是研究DNA圖譜的基本技術。主要用于基因組DNA、如在基因組中特定基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析中具有重要的價值。（二）RNA印跡技術(Northernblotting)也叫做Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的方法用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)也叫做Western雜交，或免疫印跡技術，即利用抗原-抗體反應，檢測轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異的蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。三種印跡技術的比較

其他斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(DNAchip)印跡技術的基本過程（1）制備樣品

從待檢測組織樣品提取DNA或RNADNA或RNA經(jīng)酶切消化酶切片段的電泳分離凝膠變性處理后轉(zhuǎn)膜（2）制備探針

基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA或合成的寡核苷酸。（3）雜交預雜交：用非特異的核酸溶液封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。雜交：由于轉(zhuǎn)印在膜上的核酸分子已經(jīng)是變性的分子，所以雜交過程中只需變性標記好的探針，再讓探針與膜在特定的溫度下反應，然后洗去未結(jié)合的探針分子即可。（4）檢測檢測的方法依標記探針的方法而異放射性同位素標記的探針：需要用放射自顯影來檢測其在膜上的位置；生物素等非同位素方法標記的探針：需要用相應的免疫組織化學的方法進行檢測。印跡技術的應用研究DNA分子中某一種基因的位置確定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術的基礎

第二節(jié)

PCR技術的原理與應用

PolymeraseChainReactionPCR技術（Polymerasechainreaction）

PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶鏈式反應，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA為模板，特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，在體外復制DNA的過程。是基于天然DNA復制的原理而設計的一種在體外由引物介導的DNA酶促合成反應，又稱基因擴增技術。

5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目錄Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。目錄PCR產(chǎn)物以指數(shù)形式增加，即Y=2n

(n為循環(huán)次數(shù))34×109PCR技術的基本原理

體外模擬DNA的體內(nèi)復制

嚴格遵循堿基互補配對原則DNA體內(nèi)復制與PCR的對比

模板聚合酶引物解旋解鏈體內(nèi)復制DNADNAPolⅢ引物酶解旋酶解鏈酶PCRDNATaq人工合成DNA熱變性模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分引物（primer）是一小段單鏈DNA或RNA，是DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發(fā)點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。引物設計原則引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補。

PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。1.引物長度一般在15-30堿基之間。引物長度常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。2.引物GC含量在45%-55%間，Tm值最好近72℃.GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。3.上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值5-10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55-80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。4.引物3′端要避開密碼子的第3位。如擴增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。6.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。7.引物應具有特異性。引物設計完成以后，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。三、PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?CPCR過程優(yōu)點特異性強靈敏度高

模板量要求ng級水平操作簡便快捷；對待檢原始材料質(zhì)量要求較低目的基因的分離和克隆基因的體外突變DNA的微量分析

病原微生物的檢測

遺傳病的檢測

法醫(yī)學（犯罪個體的認定；親子鑒定序列測定基因突變分析PCR的主要用途幾種重要的PCR衍生技術（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術（二）原位PCR技術（三）實時PCR技術實時PCR技術原理第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysisDNA測序的基本戰(zhàn)略

設法產(chǎn)生帶標記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，使待測的DNA鏈中的相應每個核苷酸處都有斷裂或終止。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。

核酸序列分析的基本原理化學裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)一、化學裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學試劑可以使DNA鏈在1個或2個堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應強度，使一個斷裂點僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。二、DNA鏈末端合成終止法目錄DNA的

Sanger測序法

讀出模板互補序列dNTP

凝膠電泳

較大片段

較小片段ddGTPddATPddCTPddTTP

反應混合物Klenow酶

未知序列的單鏈DNA

讀出待測序列CTGACTTCGACAAAGAA5′3′

放射性標記的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3′5′CTGACTTCGACAA5′3′DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標記是實現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎。用不同熒光分子標記四種雙脫氧核苷酸，然后進行Sanger測序反應，反應產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。DNA自動測序結(jié)果舉例引物標記法測序(DyePrimer)一個樣本，4個反應。4個反應中引物序列相同，但分別標記有不同顏色的熒光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP

反應結(jié)束后，將4管反應液混合，經(jīng)乙醇沉淀后上樣終止法測序(DyeTerminator)一個樣本，1個反應。反應中包含分別帶4色熒光標記的ddNTP(終止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP

測序反應結(jié)束后，采用乙醇沉淀法進行純化，除去過量的ddNTP后上樣。測序技術進展

同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳

多色熒光標記毛細管電泳

單色熒光標記平板電泳同位素標記平板電泳ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

C

T基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。文庫構(gòu)建的基本過程第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例第五節(jié)

生物芯片技術BiologicalChipTechnologyDNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣本進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析。由于在制備過程中運用了計算機芯片的制備技術如顯微光蝕刻、顯微打印等，且常用硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片技術一、基因芯片(genechip)目錄基因芯片技術原理大規(guī)模集成的固相雜交基本原理是核酸分子雜交，即依據(jù)DNA雙鏈堿基互補配對、變性和復性的原理

以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探針，檢測樣品中哪些核酸序列與其互補，然后通過定性、定量分析得出待測樣品的基因序列及表達的信息。生物戰(zhàn)劑檢測

臨床疾病的基因診斷法醫(yī)學鑒定藥物研究開發(fā)動植物檢疫

基因組研究后基因組計劃生物信息學基因芯片基因芯片技術的應用領域是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術。蛋白質(zhì)芯片的作用原理：蛋白質(zhì)分子間的親和反應，如抗體-抗原或者受體-配體之間的特異性結(jié)合。蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)第六節(jié)

生物大分子相互作用研究技術ThemethodofProtein-proteinandProtein-DNAintraction酵母雙雜交各種親和分析（親和色譜、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選等等常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖（二）酵母雙雜交技術的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用。二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術（一）電泳遷移率變動測定放射自顯影未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針標記探針1X1X1X1X核蛋白提取物1X10X10X未標記探針10X凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀技術(chromatinimmunoprecipitationassay,ChIP)是目前可以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖遺傳修飾動物模型的建立及應用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel第七節(jié)轉(zhuǎn)基因技術采用基因轉(zhuǎn)移技術使目的基因整合入受精卵細胞或胚胎干細胞，然后將細胞導入動物子宮，使之發(fā)育成個體。