第一章植物組織培養(yǎng)

PlantTissueCulture

植物組織培養(yǎng)2014年9月3日同學(xué)們好！

Welcometomyclass！Service01Service02Service03組培專業(yè)選修課學(xué)時(shí)：36學(xué)分：2課程簡(jiǎn)介植物組織培養(yǎng)是一門(mén)生物科學(xué)領(lǐng)域的核心技術(shù)，主要內(nèi)容：理論篇：基本概念、基本原理、基本方法和技術(shù)；應(yīng)用篇：在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)等方面的的應(yīng)用方法和技術(shù)。課程內(nèi)容定義（Definition）：

狹義：主要指對(duì)植物組織及培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)。廣義：植物組織培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)的總稱，包括器官培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)等。一、植物組織培養(yǎng)的定義植物組織培養(yǎng)的概念1.外植體（explants）：從活體植物體上切取下來(lái),進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官叫做外植體

。2.無(wú)菌:（asepsis）：指沒(méi)有活菌的意思。防止菌類進(jìn)入人體或其他物品的操作技術(shù)，稱為無(wú)菌操作。組培技術(shù)常指快速繁殖技術(shù)，又稱植物克隆。

植物組織培養(yǎng)的優(yōu)越性材料來(lái)源單一，遺傳特性一致成本低，效率高環(huán)境條件可控生長(zhǎng)快，周期短，可重復(fù)性強(qiáng)可連續(xù)生產(chǎn)，利于自動(dòng)化控制世界范圍組培苗產(chǎn)量GrowthStartJump現(xiàn)在19911985年

全世界組培苗產(chǎn)量1.3億株

已超過(guò)10億株

世界范圍內(nèi)組培苗5.1億株目前全球有關(guān)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的年交易額約為1500億美元,其中50%~60%與農(nóng)業(yè)有關(guān)。植物組培苗的貿(mào)易額約占總額的10%,即150億美元,并以每年15%速度遞增。手指玫瑰超大型煙草的搶救性克隆繁育一、植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)

脫分化和再分化理論組培植物的生長(zhǎng)發(fā)育器官發(fā)生途徑

41231.細(xì)胞全能性學(xué)說(shuō)植物體的每一個(gè)具有完整細(xì)胞核的細(xì)胞都具有該物種全部遺傳的物質(zhì)，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。脫分化（dedifferentiation)：將已分化的不分裂的靜止細(xì)胞，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，細(xì)胞重新進(jìn)入分裂狀態(tài)。一個(gè)成熟的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)的過(guò)程叫脫分化。

再分化（redifferentiation):經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同的細(xì)胞類型，形成完整植株的過(guò)程。2.植物細(xì)胞全能性的表達(dá)一個(gè)細(xì)胞一旦沿著某一條特定的途徑分化發(fā)育后，一般不會(huì)再回復(fù)到未分化狀態(tài)，但在組織培養(yǎng)條件下，可能發(fā)生脫分化和再分化。離體的植物器官、組織、細(xì)胞脫分化愈傷組織再分化根芽再生植株3.組培植物的生長(zhǎng)發(fā)育4.組織培養(yǎng)植株再生的途徑魔芋胚狀體1）體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑（胚狀體發(fā)生途徑）

：是指在組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)過(guò)胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過(guò)程（經(jīng)過(guò)原胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉胚5個(gè)時(shí)期）。胚狀體發(fā)生途徑外植體脫分化愈傷組織胚狀體再生植株再分化脫分化2）器官發(fā)生途徑：

由愈傷組織或外植體誘導(dǎo)形成不定根或不定芽，再獲得再生植株的方法。百合鱗葉培養(yǎng)外植體器官發(fā)生途徑愈傷組織芽分化再生苗小麥愈傷組織器官發(fā)生途徑外植體愈傷組織芽根再生植株脫分化再分化高生長(zhǎng)素(1,2-D)高(生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素)低(生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素)器官發(fā)生途徑胡蘿卜離體根愈傷組織（callus）在人工培養(yǎng)基上由外植體上形成的一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。葉誘導(dǎo)愈傷組織二、植物組織培養(yǎng)的類型根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象分類植株培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)器官培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)煙草的器官培養(yǎng)按培養(yǎng)基物理狀態(tài)分為:

1.固體培養(yǎng)

2.液體培養(yǎng)按培養(yǎng)過(guò)程分為:1.初代培養(yǎng)2.繼代培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)三、植物組織培養(yǎng)的發(fā)展簡(jiǎn)史探索階段（1838-1929年）：細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出奠基階段（1930-1950）：培養(yǎng)基和激素迅速發(fā)展階段（1960-至今）：植物改良1.探索階段（1838-1929年）Haberlandt：觀點(diǎn)：貢獻(xiàn)：提出細(xì)胞全能性小野芝麻、鳳眼蘭的柵欄細(xì)胞和虎眼萬(wàn)年青屬表皮細(xì)胞無(wú)分裂細(xì)胞高度分化+培養(yǎng)基中無(wú)生長(zhǎng)激素首次進(jìn)行離體細(xì)胞培養(yǎng)高等植物的組織和器官可以分割成單個(gè)細(xì)胞Knop+蔗糖《關(guān)于單離植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》我愿意指出：在我的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，雖然經(jīng)常觀察到細(xì)胞的明顯生長(zhǎng)，但從未觀察到細(xì)胞分裂。發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞培養(yǎng)的條件，將是未來(lái)培養(yǎng)試驗(yàn)的難題。在未來(lái)，人們可以成功地從營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)出人工胚。1904年：Hanning胚培養(yǎng)：培養(yǎng)蘿卜和辣根菜的胚，得到植株1922年：Knudson采用胚培養(yǎng)法獲得蘭花幼苗，克服其種子發(fā)芽困難的問(wèn)題。1925年：Laibach亞麻種間雜交幼胚培養(yǎng)得到雜種其它研究玉米成熟胚的培養(yǎng)2.奠基階段（1930-1950年）1934年：White番茄根建立第一個(gè)植物無(wú)性系。 當(dāng)根2厘米長(zhǎng)－切成0.5-1厘米切斷，無(wú)菌液體培養(yǎng)－完全相同的離體根－根離體培養(yǎng)真正成功;1934年：高特里特（Gautheret）在研究山毛柳和黑楊等形成層的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，提出了B族維生素和生長(zhǎng)素對(duì)組織培養(yǎng)的重要意義;1939年：White由煙草種間雜種的瘤組織,諾比考特（Nobecourt）由胡蘿卜均建立了與上述類似的連續(xù)生長(zhǎng)的組織培養(yǎng)物。1937年：White發(fā)現(xiàn)3種B族維生素和IAA對(duì)植物生長(zhǎng)有用組織培養(yǎng)的奠基人1943年：White植物組織培養(yǎng)手冊(cè)《AHandbookofPlantTissueCulture》，標(biāo)志組織培養(yǎng)成為一門(mén)新興學(xué)科。1946年：羅士韋在菟絲子莖尖培養(yǎng)地觀察到花的形成，為試管受精奠定了基礎(chǔ)。1948年：斯庫(kù)克(Skoog)和崔徵在煙草莖切段和髓培養(yǎng)以及器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤或腺苷可解除生長(zhǎng)素對(duì)芽生長(zhǎng)的抑制作用，腺嘌呤/生長(zhǎng)素高，生芽；低，生根；相等，不分化。從而明確了腺嘌呤與生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。1952-1953年：美國(guó)植物學(xué)家斯圖爾德（Steward）等人，用胡蘿卜根韌皮部的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到了完整植株，并且這一植株能夠開(kāi)花結(jié)實(shí)，首次證實(shí)了Haberlandt在五十多年前關(guān)于細(xì)胞全能性的預(yù)言；1952年：莫雷爾（Morel）和馬丁（Martin）通過(guò)莖尖分生組織的離體培養(yǎng)，從已受病毒侵染的大麗花中首次獲得無(wú)病毒植株；1954年：Muir將煙草愈傷組織置于固體培養(yǎng)基上，在其上放一片濾紙，再在濾紙片上放上一個(gè)煙草體細(xì)胞，單細(xì)胞培養(yǎng)成功。1956年：Miller分離出Kinetin(KT)激動(dòng)素,不久即知道激動(dòng)素可以代替腺嘌呤促進(jìn)發(fā)芽，并且效果可增加3萬(wàn)倍。3.迅速發(fā)展階段1960年以來(lái)組織培養(yǎng)理論、實(shí)踐、技術(shù)和方法不斷完善和發(fā)展，形成獨(dú)具特色的專業(yè)技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)技術(shù)上建立了較完整的實(shí)驗(yàn)程序，已成為一種重要和精細(xì)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。組織培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的許多分支學(xué)科，并取得豐碩的成果。3.1原生質(zhì)體培養(yǎng)1960年：科金Cocking——開(kāi)創(chuàng)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交研究工作（用真菌纖維素酶從番茄幼根分離得到活性原生質(zhì)體）1971年，日本

takebe和Nagata首次利用煙草葉片分離原生質(zhì)體并獲得再生植株。我國(guó)獲得了30個(gè)以上品種的原生質(zhì)體再生植株，其中包括難度較大的重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物大豆、水稻、玉米、小麥、谷子、高梁、大麥、棉花、油萊、馬鈴薯等1972年，美國(guó)Carlson誘導(dǎo)粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的原生質(zhì)體融合得到種間體細(xì)胞雜種－第一株體細(xì)胞雜種。1978年，有性雜交不親和的番茄/馬鈴薯間的體細(xì)胞雜交獲得了雜種植株(Melchers)。隨后獲得了地上結(jié)番茄，地下生馬鈴薯的雜種植物。1985年，馬鈴薯的栽培品種與野生種的體細(xì)胞雜交，得到了抗晚疫病和卷葉病的體細(xì)胞雜種(Austin)。3.2細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交蘿卜--白菜蘿卜-甘藍(lán)

避免受精后胚乳發(fā)育不良或因種胚與胚乳間不親和而致使雜種胚夭折，及時(shí)分離幼胚接種在無(wú)激素培養(yǎng)基上使之直接成苗，這就是胚挽救。大大提高遠(yuǎn)緣雜交的成功率:印度科學(xué)家在裁培種菜豆、黃麻和花生的遠(yuǎn)緣雜交中獲得了理想的重組體。中國(guó)農(nóng)科院蔬菜所培養(yǎng)結(jié)球甘藍(lán)和大白菜的雜種胚得到了種間雜種。3.3胚胎培養(yǎng)和試管內(nèi)傳粉受精技術(shù)近50年來(lái)飛速的發(fā)展。從400多種植物培養(yǎng)細(xì)胞中分離到600多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中60多種在含量上超過(guò)或等于其原植物，20種以上干重超過(guò)1％。在日本，人參細(xì)胞培養(yǎng)已達(dá)130600L發(fā)酵罐；德國(guó)用1000L發(fā)酵罐培養(yǎng)毛地黃細(xì)胞；利用培養(yǎng)細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化能力生產(chǎn)高值化合物，德國(guó)科學(xué)家進(jìn)行了出色的研究。他們?cè)诿攸S細(xì)胞的培養(yǎng)中加入生物合成途徑的中間化合物毛地黃毒素和一甲基毛地黃毒素，培養(yǎng)細(xì)胞以幾乎100％的轉(zhuǎn)化速率使之羥基化，變?yōu)獒t(yī)藥強(qiáng)心劑地高辛。3.4組織及細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用物質(zhì)1964年印度Guha和Maheshwari成功地在毛葉曼陀羅花藥培養(yǎng)中，由花粉誘導(dǎo)得到單倍體植株，從而促進(jìn)了花藥和花粉培養(yǎng)的研究；以后相繼在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、辣椒、草莓、蘋(píng)果等多種植物培養(yǎng)中獲得成功，其數(shù)目達(dá)到160多種，其中煙草、水稻和小麥等的花藥育種培養(yǎng)在中國(guó)取得了引入注目的成就?；ㄋ幣囵B(yǎng)：中花8號(hào)水稻、京花1號(hào)小麥。3.5單倍體育種3.6體細(xì)胞無(wú)性系變異：

我國(guó)已經(jīng)培育出抗白葉枯病及賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、絲氨酸和酪氨酸含量高于親本系的水稻變異體。3.7突變體誘導(dǎo)和篩選

細(xì)胞突變體的篩選最早始于1959年，Melchers在金魚(yú)草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中獲得了溫度突變體。四、植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用快速繁殖種苗脫毒遠(yuǎn)源雜交轉(zhuǎn)基因育種種質(zhì)資源的保存人工種子60年代，法國(guó)的Morel用莖尖培養(yǎng)的方法大量繁殖蘭花獲得成功。植物快速繁殖技術(shù)、試管苗工廠化生產(chǎn)和無(wú)病毒種苗生產(chǎn)技術(shù)在70年代得到了快速的發(fā)展。美國(guó)、法國(guó)、意大利、荷蘭等歐美國(guó)家試管苗的年產(chǎn)量均在數(shù)千萬(wàn)株以上，并且以每年7％-8％的速度增加。

我國(guó)快速繁殖和無(wú)病毒種苗生產(chǎn)的研究始于70年代，到“七五”期間研究成果開(kāi)始向應(yīng)用轉(zhuǎn)化并大見(jiàn)成效。馬鈴薯無(wú)毒種薯和甘蔗種苗已在生產(chǎn)上大面積種植。植物快速繁殖技術(shù)蘭花：“崇蘭生澗底，香氣滿幽林”，故又有“空谷佳人”之稱。

植物組織培養(yǎng)在技術(shù)上的發(fā)展研究材料范圍逐步擴(kuò)大培養(yǎng)方法逐步完善培養(yǎng)基不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)手段逐步完備胚、胚軸、子葉、幼苗、莖尖、根、葉等；動(dòng)物細(xì)胞+植物細(xì)胞/微生物原生質(zhì)體固體培養(yǎng)發(fā)展到液體振蕩或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)、液滴培養(yǎng)、雙層培養(yǎng)、包埋培養(yǎng)White培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等中