民院-檢驗核醫(yī)學(放射免疫分析和免疫放射分析)

檢驗核醫(yī)學第六章體外分析技術(shù)Invitroanalysistechniques概述

體外分析技術(shù)（invitroanalysistechniques）

1.廣義地講，是泛指以離體組織、血液或體液等作為生物樣本，在人體外進行的、分析樣本中成分或其含量的檢測技術(shù)。以體外放射性核素標記配體（ligand）為示蹤劑，以結(jié)合反應為基礎(chǔ)，以放射性測量為定量手段，在試管中進行的對微量生物活性物質(zhì)進行定量分析的標記免疫分析技術(shù)。主要指放射免疫分析技術(shù)（radioimmunoassay,RIA）

2.主要檢測放射性核素發(fā)射的γ射線量第一節(jié)放射免疫分析一、基本原理1.放射免疫分析（RIA）是利用放射性標記的抗原（*Ag）與非標記抗原（Ag）同時與限量的特異性抗體（Ab）進行可逆性競爭性免疫結(jié)合反應。

*Ag+Ab*Ag-Ab+*Ag+Ag

Ag-Ab+Ag*Ag和Ab量恒定2.標準曲線:利用一系列已知濃度的標準Ag(即標準品)與待測樣品在相同條件下反應后，用放射計數(shù)儀測定*Ag–Ab(B)或游離的*Ag

（F）的放射性。以各濃度點測量的相應的放射性計數(shù)（cpm）或用計算參數(shù)[B/(B+F),B/F或B/B0]為縱坐標作圖繪制標準曲線。a)Ab和*Ag

的量恒定

b)抗原抗體反應為可逆性

c)Ab和*Ag

的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)相同特點

1.靈敏度高最小可測量為10-9-10-15g2.特異性強利用專一性強的結(jié)合反應

3.精確度好有效的質(zhì)量控制方法

4.放射性不引入體內(nèi)

5.所需待測樣品少50-200l6.試劑藥盒化，操作簡便、快速

7.測量微機化，方便、快捷，客觀、準確類型

競爭性體外放射分析

標記物結(jié)合劑

放射免疫分析*AgAb(RIA)

競爭蛋白結(jié)合分析*Ag血漿中固有的

(CPBA)激素載體蛋白

(TBG)

放射受體分析*LR(RRA)

放射酶分析*SE(REA)

非競爭性體外放射分析

免疫放射分析*Ab*Ab(IRMA)

受體的放射分析*LR(RBA)

酶的放射分析*SE(ERA)放射免疫分析(RIA)基本原理1RIA反應式分離劑*Ag+Ab

*Ag-Ab

*Ag-Ab

+分離劑

AgAg-Ab

Ag-Ab

1)一定量*Ag、不定量Ag與限量Ab進行競爭抑制結(jié)合反應2)*Ag-Ab

與Ag成負相關(guān)關(guān)系(反比)3)在實際工作中，用一系列已知濃度的Ag(標準品)進行實驗制備劑量反應曲線(標準曲線，[*Ag-Ab]－[Ag]曲線)，未知樣品在相同條件下實驗，其濃度通過標準曲線查出2RIA數(shù)學函數(shù)式

k1Ag+Ab

Ag-Abk2P+QPQP=[Ag]+[*Ag]P0=[Ag0]+[*Ag0]Q=[Ab]Q0=[Ab0]PQ=[Ag-Ab]+[*Ag-Ab]k1[PQ][PQ]K=——=————=———————(1)k2[P][Q][P]([Q0]-[PQ])[PQ]=———————(2)([P0]-[PQ])[Q]

將B=

[PQ]/[P0]、B/F=B/(1-B)=[PQ]/[P]代入(1)B1K=———×———————(3)展開重排

1–B[Q0]-B[P0]

[Q0]1[Q0]

B2–B(1+———+———)+———=0(4)[P0]K[P0][P0]

將B=1-F代入(3)

[Q0]11

F2–F(1-———-———)+———=0(5)[P0]K[P0]K[P0]

定義R=B/F，由B+F=1得B=R/(1+R)代入(3)

R2+R(1+K[P0]–K[Q0])–K[Q0]=0(6)3RIA劑量反應曲線4方法流程

加樣→溫育→分離→測定→數(shù)據(jù)處理→簽發(fā)檢測報告基本試劑

1標準抗原(Ag)2標記抗原(*Ag)3抗血清(抗體，Ab)1標準抗原(Ag)

已知含量的非標記抗原用途(1)免疫動物，制備抗體

(2)制備標記抗原

(3)作為標準品參與RIA反應，繪制劑量反應曲線

要求(1)質(zhì)量上高純度與被測抗原屬同一物質(zhì)，具有相同的免疫(生物)活性，高度純化

(2)數(shù)量上高準確度分一級標準(國家或國際標準)

二級標準(廠家或?qū)嶒炇覙藴?(3)穩(wěn)定性好，便于貯存、運輸和使用2抗血清(抗體，Ab)

含有抗體的血清質(zhì)量指標(1)親和力

(2)交叉反應率

(3)滴度(1)親和力

Ab與Ag的結(jié)合能力，用親和常數(shù)K表示

Scatchard作圖法得：

B/F=K[Q0]–K[PQ]

為一直線

K=直線斜率

K>109L/mol(2)交叉反應率

Ab與Ag類似物的結(jié)合程度，表示Ab的特異性。分別用Ag和Ag類似物（Ag#）作劑量反應曲線

Ab與*Ag結(jié)合被抑制50%時[Ag]量交叉反應率=

Ab與*Ag結(jié)合

被抑制50%時[Ag#]量(3)滴度又稱效價，反映與一定量

Ag特異結(jié)合的Ab的濃度,用稀釋度表示用一定量標記Ag與不同稀釋度的Ab反應，作B%-Ab稀釋度曲線，B%=50%時對應的Ab稀釋度即為Ab滴度,

合適的滴度為1:104-1063標記Ag

常用125I和3H標記化合物要求：

(1)適當高的放射性比活度影響方法的靈敏度和精密度，標記Ag化學量≤被測Ag的最小量

(2)放射化學純度>95%影響方法的靈敏度

(3)免疫活性與未標記Ag基本保持一致

(4)穩(wěn)定性好，在一定條件下，穩(wěn)定期1-3月標記Ag與Ab的用量對測定的影響

(1)待測Ag含量較高*Ag的比活度↓Ab的滴度↓靈敏度↓曲線范圍↑

(2)待測Ag含量較低*Ag的比活度↑Ab的滴度↑靈敏度↑曲線范圍↓分離技術(shù)1非特異性

(1)吸附法分離劑：葡聚糖凝膠包被活性炭(DCC)F被吸附沉淀，重復性差

(2)沉淀法分離劑：聚乙二醇(PEG)B被沉淀，分離迅速，非特異結(jié)合率高

(3)抽濾法常用濾膜：玻璃纖維濾膜、微孔濾膜

B與F的分子量差別明顯時分離效果好2特異性分離方法

(1)雙抗體法分離劑：第二抗體(抗抗體，Ab2)

分離時間長，非特異結(jié)合率低

(2)雙抗體+PEG法分離迅速，非特異結(jié)合率低

(3)固相分離法固相材料包被Ab1、Ab2

固相材料：纖維素(包被珠)

試管(包被管)

磁化顆粒分析方法1反應方式(1)平衡加樣法：標準(待測)Ag+Ab+標記

Ag→溫育→分離→測定(2)順序加樣法：標準(待測)Ag+Ab→溫育→+標記Ag→溫育→分離→測定提高方法靈敏度的分析方法2反應介質(zhì)

Tris-HCl或PB緩沖液，pH7.4-7.8

離子強度0.05-0.1M3反應溫度和時間

K大，37?C，1-3h；K小，4?C，過夜4血樣的采集與保存

(1)大都采用原樣品(血清、血漿)，少數(shù)需經(jīng)提取

(2)不及時分析的樣品需分離出血清或血漿，-20?C存放

(3)采樣或反應時常用抗凝劑：EDTA-Na2，防腐劑：

NaN3，穩(wěn)定劑：0.5%BSA、0.1%明膠、抑肽酶等RIA反應管類型

組類型基本反應試劑分離別名稱常用符號AgAb*Ag試劑

總放射性管T--√-

標準非特異結(jié)合管N--√√

曲線組最大結(jié)合管B0(S0)-√√√

標準管Si√√√√

樣品組樣品管U√√√√

質(zhì)控組質(zhì)控管QC√√√√數(shù)據(jù)處理

1B%—D曲線

2B%—LogD

半對數(shù)反“S”曲線

3B/B0%—LogD

半對數(shù)反“S”曲線

4LogitB/B0—LogD

全對數(shù)直線

5四參數(shù)或五參數(shù)Logistic模型曲線

6四參數(shù)單位點質(zhì)量作用模型曲線

RIA的質(zhì)量控制質(zhì)量控制的目的對分析工作中產(chǎn)生的誤差進行檢查和質(zhì)量判斷，對出現(xiàn)的質(zhì)量異常現(xiàn)象尋找原因并采取糾正措施，以保證分析誤差被控制在允許的范圍內(nèi)。杜絕過失誤差，校正系統(tǒng)誤差，控制隨機誤差。質(zhì)量控制的內(nèi)容(任務)1實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制(1)批內(nèi)質(zhì)控精密度評價偏差分析

(2)批間質(zhì)控精密度評價偏差分析2實驗室外部質(zhì)量控制(1)對某種分析方法的試劑或試劑盒進行綜合評價

(2)對不同實驗室的分析工作質(zhì)量進行比較質(zhì)量控制樣品質(zhì)控的“標準系統(tǒng)”－質(zhì)控血清(QC)要求：1QC樣品與待測樣品性質(zhì)相同

2QC樣品與待測樣品中待測物相同，免疫活性一致

3QC樣品中待測物量已知，分高、中、低三檔濃度

4足量制備，分裝，低溫存放，分批使用制備方法：1按三檔濃度收集多余病人血清，測定標示值

2在緩沖溶液中加入無待測物的蛋白質(zhì)，再溶入三檔濃度待測物標準品，測定標示值使用方法：QC樣品組數(shù)＝√待測樣品總數(shù)/3

以組為單位在待測樣品中前、中、后放置測定質(zhì)量控制指標1靈敏度能檢測出與B0管具統(tǒng)計差別的最小可測量

(1)B0%-2SD的相應劑量(2)B0%-10%的相應劑量

(3)由精密度圖得出2特異性抗體識別其抗原的能力，用交叉反應率表示3精密度在相同條件下，對某一樣品多次檢測所得結(jié)果的符合程度，評價隨機誤差∑(Xi–X)2

|X1–X2|SD=———————n=2時，SD=—————n–1√24偏差測定值偏離真值的程度，評價系統(tǒng)誤差準確度測定值與真值的符合程度，評價系統(tǒng)誤差和隨機誤差測定值-真值偏差b=———————X100%

真值準確度=√偏差2+精密度2=√b2+SD25穩(wěn)定性批間的重復性

B0%、NSB%、ED25、ED50、ED75、QC樣品測定值6臨床有效性一項分析方法完成臨床目的的程度正常值及其范圍、正常值與異常值交叉范圍、診斷符合率(陽性率、陰性率、假陽性率、假陰性率)實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制方法1對實驗數(shù)據(jù)進行審核剔除“壞點”2劑量反應曲線擬合及質(zhì)量審核3精密度評價(1)反應誤差關(guān)系RER

從多批實驗資料求出直線方程式

SDR=a+bRa反映分離誤差b反映加樣誤差(2)精密度圖(P-P圖)

(用劑量反應曲線)

通過RER將SDR轉(zhuǎn)換SDD(CVD%)

作SDD(CVD%)-lgD曲線CVD%≤10%4偏差與準確度評價

(1)回收實驗反映偏差測定值-空白值回收率%=—————X100%

已知值回收率%=100%±10%(2)健全性試驗用標準品和樣品分別作劑量反應曲線和樣品稀釋曲線，兩條曲線應平行

(3)二樣本-Youden圖反映準確度，用QC樣品

QC首-QC尾曲線，誤差≤±2SD5穩(wěn)定性評價批間質(zhì)控，用QC樣品

(1)Cusum圖每批QC測定值與靶值的差累計后按批次連續(xù)作圖，折線兩端落差≤±5SD(2)質(zhì)控圖

QC測定值-批次曲線，誤差≤±3SD評價

1三種濃度<2SD，雙向（±

）或兩種濃度<2SD，一種<3SD，雙向正常

2三種濃度>2SD，但<3SD，雙向或一種>3SD，雙向隨機誤差大

3三種濃度中一種>3SD，兩種>2SD，三種>1SD，單向（＋或－）系統(tǒng)誤差大免疫放射分析(IRMA)基本原理1IRMA反應式

(1)單位點Ag+*Ab

?Ag-*Ab+*Ab

SP-AgAg-*Ab+SP-Ag-*Ab

(2)雙位點SP-Ab1+Ag?SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2SP：表示固相2IRMA數(shù)學函數(shù)式

k1Ag+*Ab

Ag-*Abk2P+QPQP=[Ag]P0=[Ag0]Q=[*Ab]Q0=[*Ab0]PQ=[Ag-*Ab]=Bk1[PQ][PQ]K=—=———=——————————k2[P][Q]([P0]-[PQ])([Q0]-[PQ])B=————————展開重排

([P0]-B)([Q0]-B)

B2–B([P0]+[Q0]+1/K)+[P0][Q0]=03劑量反應曲線方法分類1雙抗體夾心法（1）SP-Ab1+Ag?SP-Ab1-Ag

*Ab2SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（2）Ag+*Ab2

?Ag-*Ab2+*Ab2

SP-Ab1SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab2

（3）SP-Ab1+Ag+*Ab2

?SP-Ab1-Ag-*Ab2+*Ab22標記第三抗體

SP-Ab1+Ag+Ab2

SP-Ab1-Ag-Ab2

*Ab3

SP-Ab1-Ag-Ab2-*Ab3*Ab3：第三抗體（抗抗體），為兔（豚鼠）抗小鼠IgG抗血清優(yōu)點：通用性標記抗體3雙標記抗體法*Ab2*Ab2SP-Ab1+AgSP-Ab1-AgSP-Ab1-Ag*Ab3*Ab3

優(yōu)點：放射性比活度提高，就提高了方法的靈敏度和精密度影響免疫放射分析的主要因素1被測抗原的性質(zhì)雙位點IRMA要求被測抗原有兩個以上的結(jié)合位點，方法局限于多肽和蛋白質(zhì)抗原的分析2結(jié)合在固相抗體上的抗原穩(wěn)定性被結(jié)合的抗原數(shù)量較多時，抗原從固相抗體上分離的傾向更明顯高濃度的準確度較低濃度差3反應時間和溫度室溫或4?C，24h；37?C，1.5-3h4標記抗體的濃度標記抗體↑，測定范圍↑，NSB↑5固相物的洗滌洗滌↓，CPM↑，洗滌↑，CPM↓6血清等的非特異性效應溫度↑，血清效應↑IRMA反應管類型組類型基本反應試劑分離別名稱常用符號Ag*Ab

試劑

總放射性管T-√-

標準非特異結(jié)合管N(S0)-√√

曲線組