研究生開題報(bào)告

學(xué)術(shù)論文開題報(bào)告

基質(zhì)金屬蛋白酶與癲癇發(fā)病的關(guān)系專業(yè)名稱：神經(jīng)病學(xué)研究方向：癲癇協(xié)作單位：青大醫(yī)學(xué)院日期：2004年12月28日一、選題的目的和意義（主要說明：進(jìn)行研究的必要性、預(yù)期達(dá)到的目的、實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和學(xué)術(shù)意義）本研究是為了明確基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織相容性抑制因子（MMPs/TIMPs）是否參與了癲癇的發(fā)病，可能是以怎樣的機(jī)制參與。通過該試驗(yàn)，應(yīng)可證實(shí)：MMPs/TIMPs，主要是MMP-9/TIMP-1參與了癲癇的發(fā)病，可能是通過增加了血腦屏障的通透性，加強(qiáng)了腦內(nèi)的免疫反應(yīng)，損害了神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，影響突出重建，從而影響癲癇放電環(huán)路的形成。同時(shí)該試驗(yàn)可指導(dǎo)臨床上選擇特異性MMPs抑制因子，抑制該病理過程，從而緩解癲癇的發(fā)作。這將為癲癇的免疫學(xué)機(jī)制提供有意義的線索。二、國內(nèi)外研究動態(tài)引文癲癇的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前關(guān)于癲癇的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究，主要集中在腦組織抗原和抗腦抗體的尋找。星形膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗原在發(fā)生免疫反應(yīng)和損傷的腦屏障部位，與外周循環(huán)免疫系統(tǒng)發(fā)生接觸，并且其相應(yīng)特異性抗體以遵循同一途徑進(jìn)入腦組織內(nèi)，造成該膠質(zhì)細(xì)胞的免疫損傷，破壞了腦神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的反饋抑制環(huán)路的平衡而導(dǎo)致興奮性神經(jīng)元過度放電和傳播。當(dāng)這種過度放電達(dá)到一定強(qiáng)度和范圍時(shí)，即會發(fā)生癇性抽搐。MMPs/TIMPs是中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)發(fā)生聯(lián)系的物質(zhì)，它與癲癇的關(guān)系越來與引起人們的關(guān)注。MMPs是一組結(jié)構(gòu)中含有Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶家族，是催化細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶類之一，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，如膠原蛋白、蛋白多糖、纖維結(jié)合蛋白等。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[1]主要來源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，浸潤入腦的炎癥細(xì)胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有細(xì)胞如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。MMPs共有二十多個成員，根據(jù)作用底物不同分為四類，即（1）膠原酶(MMP-1、MMP-8、MMP-13)；（2）明膠酶(MMP-2、MMP-9)；（3）基質(zhì)溶解酶(MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-11、MMP-12)；（4）模型基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17)。。MMPs的功能主要有二，一是幾乎能降解除了糖以外的所有細(xì)胞外基質(zhì)成分，其二是激活別的MMPs，形成瀑布效應(yīng)。MMPs的自我平衡調(diào)節(jié)是通過其內(nèi)源性抑制因子TIMPs完成的。TIMPs家族主要有四個成員（TIMP-1、－２、－３、－４）,他們與MMPs間的特異性抑制關(guān)系并不十分清楚.但TIMP-1和TIMP-2分別對MMP-9和MMP-2有較特異的抑制作用[2]。MMPs／TIMPs與血腦屏障（BBB）

BBB通透性增強(qiáng)，與血管性水腫及顱內(nèi)高壓相關(guān)。某些致病因素如感染、偏頭痛、中風(fēng)，外傷等，可通過使內(nèi)皮細(xì)胞收縮[3]

或者釋放蛋白酶和自由基[4]等機(jī)制激活MMPs而改變血腦屏障的通透性［2、4，5］。MMPs破壞內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接、周細(xì)胞（pericyte），星形膠質(zhì)細(xì)胞足突和基膜?；?nèi)含有ECM如膠原蛋白Ⅳ，層粘連蛋白和纖維連接蛋白，大多數(shù)是MMPs的底物（特別是MMP-2和MMP-9）。這可能是BBB通透性增加的主要原因。腦內(nèi)MMPs特別是MMP-9隨著血腦屏障通透性增高而增高。MMPs具體通過何機(jī)制引起血腦屏障破壞，仍待進(jìn)一步研究。血腦屏障破壞后，炎癥細(xì)胞及其產(chǎn)生的致病因子進(jìn)入腦組織，引起腦損傷。

MMPs／TIMPs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)

MMPs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及自身免疫性疾?。ㄈ缍喟l(fā)性硬化）相關(guān)，參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫反應(yīng)。病毒［1，6］侵入機(jī)體，激活T淋巴細(xì)胞，浸潤至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過分泌細(xì)胞因子刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有細(xì)胞（主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞）表達(dá)MMPs，TIMPs（MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-12和TIMP-1、TIMP-2、TIMP－3）。激活的T淋巴細(xì)胞也可和星形膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，使后者表達(dá)MMP-3、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2。MMP-9的活性還與浸潤到腦的中細(xì)粒細(xì)胞有關(guān)，在腦組織血管周隙的神經(jīng)細(xì)胞中可有單核細(xì)胞浸潤表達(dá)的MMP-9，這與淋巴細(xì)胞通過血腦屏障的能力有關(guān)[7]與此役以相同的是YushchenkoM等[29]發(fā)現(xiàn)，MMP-9的表達(dá)與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的腦脊液中細(xì)胞數(shù)升高有關(guān)。若腦脊液中細(xì)胞數(shù)正常，MMP-9的表達(dá)水平就沒有改變。T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子包括前炎癥細(xì)胞因子（TNF-α，TNF-β，IL-1α）和抗炎癥細(xì)胞因子（IL-4，IL-5）；前炎癥細(xì)胞因子使MMP-3，MMP-9和TIMP-3表達(dá)上調(diào)[9]，而抗炎癥細(xì)胞因子與TIMP-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。前炎癥細(xì)胞因子誘導(dǎo)MMPs過表達(dá)[8]，但對TIMPs的影響較小，引起MMPs/TIMPs表達(dá)的平衡失調(diào)。T淋巴細(xì)胞刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TIMPs，是控制MMPs的上調(diào)的反應(yīng)。但在該試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠺IMP-1和TIMP-3未抑制蛋白酶活性。這可能與MMP-3表達(dá)增多有關(guān)，MMP-3參與激活酶原形式的MMP-9，這就從另一方面加劇了MMPs/TIMPs表達(dá)比例的失調(diào)。所以說，MMPs/TIMPs平衡的改變與免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括T淋巴細(xì)胞激活，高度相關(guān)。淋巴細(xì)胞透過血腦屏障依賴于黏附分子的協(xié)調(diào)連接[11]，細(xì)胞因子及其受體相互作用，也需要MMPs和TIMPs的作用。可通過增加BBB的通透性，促進(jìn)免疫分子透過血腦屏障［2，12］。T淋巴細(xì)胞不僅能產(chǎn)生MMPs，還能產(chǎn)生TIMP-1，其透過血腦屏障的能力較B淋巴細(xì)胞低。但MMPs在免疫細(xì)胞透過血腦屏障過程中的具體作用并不清楚。TNF-α和IFγ[13]誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞縫隙連接的形成，細(xì)胞－細(xì)胞縫隙連接的形成，整合蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附[6]也參與了MMPs水平的改變。在多發(fā)性硬化中[14,15]，CD8＋細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表達(dá)MMPs，MMPs通過參與BBB的破壞，使中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘和抗原決定簇?cái)U(kuò)散，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的持續(xù)降解可暴露額外的自身抗原，使自身免疫反應(yīng)持續(xù)存在。ONO-4817（一種人工合成MMPs抑制因子）可以通過抑制MMPs，T淋巴細(xì)胞增殖和減少TNF-α生成，進(jìn)而顯著減輕BBB的破壞，又可抑制炎癥細(xì)胞浸潤和髓鞘破壞，從而有效延緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）[16]。也即，MMPs通過免疫機(jī)制參與了多發(fā)性硬化脫髓鞘的病理變化。在與人類免疫缺陷病毒－1相關(guān)的癡呆的研究過程中[17]，MMPs／TIMPs通過影響了單核巨噬細(xì)胞的遷移，參與其病理過程。病毒感染和／或免疫激活單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成的巨噬細(xì)胞及胎兒小膠質(zhì)細(xì)胞，表達(dá)MMP-1、-2、-3、-9、TIMP-1，TIMP-2。MMPs的表達(dá)促進(jìn)了單核巨噬細(xì)胞的分化，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的MMPs激活了CD40配體介導(dǎo)的細(xì)胞。MMPs引起B(yǎng)BB也參與了這一過程，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮其病理作用。MMPs還可能通過直接的降解腦內(nèi)ECM，參與了該病理過程。MMPs/TIMPs在癲癇腦中表達(dá)的研究在海人酸(KA)誘導(dǎo)的癲癇模型中，癇性發(fā)作后，可檢測到MMP-9mRNA和MMP-9蛋白的表達(dá)上調(diào)，MMP-9活性增強(qiáng)[18]，TIMP-1mRNA和TIMP-1蛋白的表達(dá)上調(diào)，TIMP-1的活性也增強(qiáng)［19］。充分提示MMP-9/TIMP-1與癇性發(fā)作相關(guān)。同時(shí)報(bào)道還提示，以上改變呈時(shí)間依賴性和部位特異性MMPs的表達(dá)原位雜交和免疫組化分析［19］，正常情況下，MMP-9在神經(jīng)元表達(dá)豐富，在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)很低。亞細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9主要集中在核周區(qū)，也可在近樹突區(qū)。而MMP-2的表達(dá)則不同，該實(shí)驗(yàn)中主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而Vaillant等［20］發(fā)現(xiàn)MMP-2主要表達(dá)在小腦神經(jīng)元和它們的樹突，而不是膠質(zhì)細(xì)胞中，Zuo等［21］在樹突生長帶測到MMP-2。這些差異可能與各實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的抗體不同有關(guān)。但正常成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中確實(shí)有MMPs的表達(dá)，而且表達(dá)水平和在細(xì)胞中的分布的差異可能受神經(jīng)元發(fā)育和/或神經(jīng)元功能狀態(tài)調(diào)節(jié)。KA注射后，MMP-9mRNA、MMP-9蛋白和酶活性特異性的時(shí)空分布特點(diǎn)。在海馬，KA理后2h，酶原形式的MMP-9的活性已增高，6h達(dá)高峰，24h時(shí)其活性開始降低，但仍高于對照組。24h之后，隨著酶原形式MMP-9的降低，其活性形式逐漸增多。在早期，MMP-9的聚集是由突觸活動增強(qiáng)引起的，是神經(jīng)元活動依賴性的［22］。后期，是一些參與組織重塑的因子使MMP-9mRNA上調(diào)并轉(zhuǎn)化為活性形式，這些因子包括神經(jīng)營養(yǎng)因子，生長因子和粘附分子。MMP-9mRNA主要分布在海馬CA1和CA3的顆粒細(xì)胞層和齒狀回的顆粒細(xì)胞，MMP-2mRNA分布較均一，尤其在大腦灰質(zhì)，但表達(dá)水平較MMP-9mRNA低。MMP-9主要分布在齒狀回的顆粒細(xì)胞和部分膠質(zhì)細(xì)胞，在CA1－3區(qū)和齒狀回MMP-2的表達(dá)極低。KA注射后，MMP-9mRNA在齒狀回顆粒細(xì)胞的樹突區(qū)表達(dá)增多，活性增強(qiáng)，。說明MMP-9mRNA從胞體轉(zhuǎn)移至樹突區(qū)，該轉(zhuǎn)移促進(jìn)了樹突合成突觸蛋白［23］。該試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，易損區(qū)（CA1、邊緣皮質(zhì)，杏仁體區(qū)）未能測到MMP-9蛋白和及其mRNA，提示MMP-9不會引起細(xì)胞死亡。而重組MMP-9能選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)基上錐體細(xì)胞的死亡，并能加劇KA誘導(dǎo)的神經(jīng)元活動而引起的神經(jīng)元死亡。也就是說，MMP-9與神經(jīng)元死亡的關(guān)系并不明確。另有研究提示，KA注射后12h，顳葉MMP-9的表達(dá)，在成年大鼠較幼年鼠顯著增多。以上資料表明，MMPs特別是MMP-9參與了興奮毒性反應(yīng)后神經(jīng)元的損害，以及繼發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，可能通過影響突觸的生理活性，參與了興奮依賴性的樹突結(jié)構(gòu)重建。TIMPs的表達(dá)RiveraS[24]等用KA誘導(dǎo)大鼠興奮毒性發(fā)作，觀察其中樞神經(jīng)系統(tǒng)中TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果顯示，TIMP-1在癇性發(fā)作后是作為一種早期反應(yīng)基因，先在神經(jīng)元中被誘導(dǎo)而表達(dá)上調(diào)。隨后，在膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)也增強(qiáng)。KA處理后，TIMP-1mRNA首先在海馬區(qū)迅速增多；KA注射后8h，TIMP-1蛋白在圍胞體區(qū)和樹突-軸突的免疫反應(yīng)增強(qiáng)；KA處理后3d，免疫反應(yīng)在膠質(zhì)細(xì)胞和抵抗性神經(jīng)元如齒狀回細(xì)胞的胞體及樹突-軸突區(qū)增強(qiáng)。提示：TIMP-1在聯(lián)系癇性發(fā)作引起的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞早期細(xì)胞反應(yīng)事件和介于組織重組和/或神經(jīng)保護(hù)長時(shí)間變化的調(diào)節(jié)過程中，可能有一定的作用。癇性發(fā)作改變了神經(jīng)元內(nèi)TIMP-1分布和表達(dá)水平。多數(shù)相關(guān)研究中，癇性發(fā)作后TIMP-1mRNA表達(dá)上調(diào)，隨后通常有TIMP-1免疫反應(yīng)的增強(qiáng)。事實(shí)上，KA注射后90分鐘時(shí)，齒狀回顆粒細(xì)胞TIMP-1mRNA的大量而快速表達(dá)。KA注射后8h時(shí)，TIMP-1免疫活性的增高。KA注射后72h，TIMP-1mRNA恢復(fù)到對照組水平時(shí)，顆粒細(xì)胞免疫反應(yīng)升高。海馬區(qū)在KA注射后8-16h，TIMP-1免疫反應(yīng)主要在錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的圍胞體區(qū)和樹突區(qū)增強(qiáng)，說明TIMP-1蛋白通過分泌途徑轉(zhuǎn)移定位。KA注射后72h，TIMP-1的免疫反應(yīng)不僅在海馬的樹突-軸突區(qū)顯著增強(qiáng)，在顆粒細(xì)胞胞體也顯著增強(qiáng)，提示隨著時(shí)間的改變，TIMP-1的合成、貯存、運(yùn)輸和分泌的調(diào)節(jié)不同。這些神經(jīng)元內(nèi)TIMP-1的遲發(fā)性聚集，可能是由于在膠質(zhì)細(xì)胞主要作用于胞外TIMP-1庫時(shí)，其分泌減少。此時(shí)，CA1區(qū)變性，持續(xù)的TIMP-1mRNA表達(dá)與該亞區(qū)神經(jīng)元內(nèi)免疫反應(yīng)增強(qiáng)無關(guān)。這表面上的矛盾可能由于TIMP-1轉(zhuǎn)化能力改變，或者由于該蛋白的蛋白分解作用增強(qiáng)。此外，膠質(zhì)細(xì)胞浸潤到CA1神經(jīng)元層可能對保持較高的TIMP-1mRNA水平有作用。結(jié)果提示：在易損CA1神經(jīng)元內(nèi)TIMP-1蛋白的缺乏和抵抗的顆粒細(xì)胞TIMP-1蛋白的表達(dá)之間存在有意義的聯(lián)系。在腦的興奮毒性發(fā)作中，局灶的MMPs/TIMPs比例改變，有病理學(xué)意義。TIMP-1先在神經(jīng)元，之后在膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，說明TIMP-1的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)在癇性發(fā)作腦內(nèi)可能有細(xì)胞和刺激依賴性。盡管神經(jīng)元的高度興奮性可以誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)早期TIMP-1的表達(dá)，但是在癇性發(fā)作始動期，其他因素即可影響神經(jīng)元內(nèi)TIMP-1的表達(dá)，稍后可影響其在膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)。這些因素包括前炎癥細(xì)胞因子（如IL-1β，TNF-α）和堿性成纖維生長因子（bFGF），是可由癇性發(fā)作誘導(dǎo)并可能在損傷后參與組織修復(fù)的因子。TIMP-1，除了具有已被廣泛認(rèn)識的抑制MMPs的功能，還表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)活性。且由于癇性發(fā)作后細(xì)胞內(nèi)短暫的TIMP-1表達(dá)，TIMP-1可能在神經(jīng)細(xì)胞間營養(yǎng)作用的級聯(lián)反應(yīng)過程中有一定作用值得注意的是，TIMP-1的免疫反應(yīng)在72h依然很強(qiáng)烈，且14d時(shí)在形態(tài)學(xué)類似星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞中繼續(xù)升高，這主要在腦的易損區(qū)如海馬，杏仁核或內(nèi)嗅區(qū)觀察到。綜上所述，癇性發(fā)作后，星形膠質(zhì)細(xì)胞對腦組織重塑的作用，是基于它們引起細(xì)胞外基質(zhì)成分改變的能力，也能通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs的比例來調(diào)節(jié)它的轉(zhuǎn)換。KA注射后2周，海馬樹突區(qū)和膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)仍可見到增強(qiáng)的TIMP-1的免疫反應(yīng)，這一事實(shí)強(qiáng)有力的證明了，TIMP-1參與了癇性發(fā)作后組織重塑。綜上所述，MMPs/TIMPs,以MMP-9/TIMP-1的研究較為明確，在KA注射后8h，在齒狀回顆粒細(xì)胞表達(dá)增多。MMP-9的表達(dá)由胞體區(qū)（核周和近樹突區(qū)）轉(zhuǎn)移到樹突區(qū)。TIMP-1在KA注射后8h，在神經(jīng)元樹突區(qū)和樹突-軸突區(qū)反應(yīng)增強(qiáng)；3d時(shí)，在膠質(zhì)細(xì)胞和耐受性神經(jīng)元如齒狀回細(xì)胞的胞體及樹突軸突區(qū)增強(qiáng)。腦易損區(qū)海馬的CA1，TIMP-1表達(dá)缺乏，MMP-9表達(dá)亦不明顯。另外，MMP-9在神經(jīng)元中的表達(dá)是神經(jīng)元活動依賴性的，而TIMP-1的表達(dá)是非神經(jīng)元活動依賴性的。KA誘導(dǎo)的大鼠興奮毒性發(fā)作過程中，神經(jīng)元活動可誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)升高，前炎癥細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MMPs/TIMPs，在不同時(shí)期，由不同部位的細(xì)胞表達(dá)。而且MMPs/TIMPs在細(xì)胞中的分布也發(fā)生改變，這可能是神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生突觸聯(lián)系的基礎(chǔ)。同時(shí)MMPs分解腦組織細(xì)胞外基質(zhì)，MMPs/TIMPs分布不一致及比例失調(diào)，都參與了興奮毒性誘導(dǎo)的癇性發(fā)作。小結(jié)MMPs/TIMPs，作為調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞外基質(zhì)的一個酶系，受多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)，保證了腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在某些致癇因子的的刺激下，MMPs／TIMPs的表達(dá)發(fā)生改變，與腦內(nèi)免疫反應(yīng)互相促進(jìn)，共同參與了癲癇的發(fā)病過程。在癥狀性癲癇當(dāng)致癇因子刺激機(jī)體時(shí)，機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞在細(xì)胞因子的刺激下表達(dá)MMPs，MMPs和炎癥反應(yīng)通過不同的機(jī)制，都可使BBB通透性增加。BBB破壞后，激活了腦內(nèi)的免疫反應(yīng)，引起了腦損傷。免疫細(xì)胞表達(dá)MMPs/TIMPs，免疫反應(yīng)同時(shí)激活了腦固有細(xì)胞表達(dá)MMPs/TIMPs，使其在腦內(nèi)的表達(dá)水平提高。MMPs/TIMPs可通過其本身的生物學(xué)作用，降解腦的細(xì)胞外基質(zhì)，打破腦內(nèi)壞境的穩(wěn)定，這可能影響了腦內(nèi)某些信號通道的生理功能，如Ca2＋通道和Na＋通道。還可以影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樹突重建，從而參與癇形放電環(huán)路的形成。癲癇作為一種臨床常見疾病，其發(fā)病機(jī)制尚欠清楚，MMPs/TIMPs可能通過免疫機(jī)制參與其發(fā)病，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。明確它們之間的關(guān)系，有利于臨床上選擇特異性MMPs的抑制因子，阻止癇性放電，從而治療癲癇。參考文獻(xiàn)[1]ZhouJh,StohlmanSA,AtkinsonR,etal.

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