一DNA的生物合成

第一節(jié)DNA生物合成的基本規(guī)律第二節(jié)DNA的生物合成第三節(jié)DNA的損傷與修復第四節(jié)DNA重組本章重點與難點重點：DNA復制的基本過程。難點：DNA的半保留復制、半不連續(xù)復制。DNA的核苷酸順序信息編碼著細胞RNA和蛋白質的一級結構，并通過酶影響所有細胞成分的合成，決定各種生物的大小、形狀和功能。DNA在生物大分子中占有中心的位置大腸桿菌遺傳圖第一節(jié)DNA復制的一般原理復制的方式—半保留復制(semi-conservativereplication)雙向復制(bidirectionalreplication)半不連續(xù)復制(semi-discontinuousreplication)

需要引物(primer)一、DNA復制是半保留復制(semi-conservativereplication)概念：DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基互補配對原則（A:T,G:C），由DNA聚合酶催化合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈來自親代，另一股單鏈則是新合成的。兩個子代DNA和親代DNA堿基序列完全一致。這種復制方式稱為半保留復制。

DNA以半保留方式進行復制，是在1958年由M.Meselson

和F.Stahl所完成的用同位素示蹤標記加密度梯度離心技術實驗所證明。DNA半保留復制的實驗依據(jù)按半保留復制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性，是生物保持遺傳穩(wěn)定性的基礎。半保留復制的意義原核生物復制時，DNA從原點

(復制的起始點，origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復制叉(replicationforks)，稱為雙向復制。

二.DNA復制是固定起點的雙向復制DNA復制的方式大腸桿菌環(huán)狀

DNA復制時所形成的θ結構起始點oriC復制叉的推進復制叉起始點，原點(O)，富含AT,產(chǎn)生瞬時單鏈起始點起始點復制叉復制叉未復制DNA單向復制雙向復制5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’復制子真核生物每個染色體有多個復制原點，習慣上把兩個相鄰復制原點之間的距離定為一個復制子(replicon)。復制子是能夠獨立完成復制的功能單位。真核生物是多復制子的復制。三.DNA復制是半不連續(xù)復制3535解鏈方向3′5′3′3′5′領頭鏈(leadingstrand)隨從鏈(laggingstrand)先導鏈連續(xù)復制而隨后鏈不連續(xù)復制，稱為半不連續(xù)復制或復制的半不連續(xù)性。四.需要引物DNA聚合酶不能從頭合成一段新鏈，參與DNA復制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’-端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

第二節(jié)DNA的生物合成一、合成的反應通式及反應方向目錄DNA聚合酶反應通式：

(dNMP)n

+

dNTP→(dNMP)n+1

+

PPi

反應方向：5’3’參與DNA復制的物質底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DDDP或DNA-pol模板(template):解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白質因子二、原核生物參與DNA聚合反應的酶類及蛋白質（DNA復制酶系統(tǒng)）一）DNA聚合酶二）拓撲異構酶(topoisomerase)三）DNA解鏈酶(DNAhelicase)四）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)五）DNA連接酶（DNAligase）六）單鏈結合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)一）DNA聚合酶全稱：DNA依賴的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)簡稱：DNA-pol功能：DNA聚合酶活性，合成DNA鏈。

DNA外切酶活性，DNA錯配后的修復，或切去RNA引物。5′CGCTTCAGGATA3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′

35外切酶活性

53外切酶活性?能切除突變的DNA片段和RNA引物。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。核酸外切酶活性目錄原核生物的DNA聚合酶大腸桿菌中相繼發(fā)現(xiàn)了三種主要的DNA聚合酶：DNA-polⅠ：5’-3’聚合酶活性，DNA合成。3’-5’外切酶活性，錯配修復。5’-3’外切酶活性，在細胞DNA復制、重組和修復中起到修繕工的作用。DNA-polⅡ：表現(xiàn)出高度專一于DNA損傷修復功能。DNA-polⅢ：是大腸桿菌DNA復制中主要的酶。編輯校對DNA的主要復制酶參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復修復合成、切除引物、填補空隙功能2040400分子數(shù)/細胞≥10≥4個1亞基數(shù)--+5外切酶活性+++5外切酶活性+++5聚合酶活性polIIIpolIIpolIE.Coli中的DNA聚合酶多聚化速度（核苷酸/秒）16-20反應速度慢持續(xù)性低40250-1000DNA-polⅢ：由十種亞基22個組分構成，其中α、ε、θ3個亞基組成核心酶，α亞基具有5‘→3’聚合DNA的酶活性；而ε亞基具有3‘→5’外切酶的活性，與DNA復制的校正功能有關，θ亞基可能與核心酶的組裝有關。每個亞基至少有一個拷貝。2個β亞基構成滑動鉗蛋白，幫助核心酶與模板結合。其它多個亞基組成滑動鉗裝載復合物。DNA聚合酶Ⅲ全酶二）DNA拓撲異構酶(DNAtopoisomerase)

又稱DNA松弛酶（DNA-relaxingenzyme)，簡稱Top，是一類催化同一DNA分子中不同超螺旋狀態(tài)之間轉變的酶。10

8局部解鏈后作用特點：既能水解、又能連接磷酸二酯鍵分類：拓撲異構酶Ⅰ:切斷DNA中的一條鏈，使DNA旋轉,減少負超螺旋，再將切斷的單鏈連接起來。拓撲異構酶Ⅱ:可以切斷DNA的兩條鏈,引入負超螺旋。需消耗ATP.三）解鏈酶（unwindingenzyme），又稱解螺旋酶。用于解開DNA雙鏈，使埋藏在DNA雙螺旋分子中的堿基對暴露出來作為模板以合成新鏈。每解開一對堿基間的氫鍵，需消耗兩分子ATP。大多數(shù)解螺旋酶與隨后鏈模板DNA結合后沿5‘-3’運動。四）引發(fā)酶(primase)又稱引物合成酶：催化前導鏈和隨后鏈岡崎片段引物的合成。引發(fā)酶本質上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3‘-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。與另外的6種蛋白質組成引發(fā)體（primosome）才起作用。五）DNA連接酶催化一個DNA鏈的3-OH末端和相鄰DNA鏈的5-磷酸末端之間的連接，形成共價磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整鏈的酶。DNA連接酶連接堿基互補雙鏈中的單鏈缺口，不能催化兩條游離DNA鏈相連；只能催化兩條多核苷酸鏈連接，不能催化單核苷酸的延長。在復制、修復、重組及剪接中起最后缺口縫合的作用。DNA連接酶催化的條件是：①未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，其中有一條鏈是完整的；②需一段DNA片段具有3’-OH，而另一段DNA片段具有5’-Pi基；③

需要消耗能量。六）單鏈結合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。是一些能夠與單鏈DNA結合的蛋白質因子。作用：①

穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復制子代DNA；②

保護單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

一）復制的起始1.復制起始于原點oriC：E.coli復制起始點oriC結構由245個高度保守的堿基對組成，由3個13bp的重復順序和4個9bp的重復順序組成的保守序列，富含A、T。三、原核生物的DNA生物合成

三個階段：起始、延伸和終止。GATCTNTTNTTT成串排列的三個13bp序列共有序列/交感順序共有序列/交感順序TTATCCACA

DnaA蛋白結合位點四個9bp序列2.DNA復制的起始過程預引發(fā)：參與打開原點的預引發(fā)復合物（起始復合物）由至少9個不同的蛋白質和酶組成。DnaA：大約20個，結合于原點的9bp重復序列，識別并變性原點13bp重復序列。DnaB(解螺旋酶):在DnaC參與下與局部解鏈的單鏈結合，沿解鏈方向繼續(xù)移動，解開足夠用于復制的長度，并逐步置換出DnaA

，形成兩條單鏈DNA，創(chuàng)造兩個潛在的復制叉。DnaADnaB(解螺旋酶)SSB單鏈DNA結合蛋白（SSB）結合在兩條單鏈DNA上，形成復制叉。拓撲異構酶使DNA的超螺旋解開。引發(fā)：引物酶和解鏈模板上的DnaB

、DnaC蛋白，DNA復制起始區(qū)域結合成復合物引發(fā)體，在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

3535引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子

引物3'HO5'引發(fā)酶二）復制的延長復制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。延長是指前導鏈和滯后鏈的合成。

1.聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以親代DNA鏈為模板，從5’→3’方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復制延長的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長隨從鏈)和δ（延長領頭鏈）。順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為先導鏈或領頭鏈(leadingstrand)。隨從鏈的合成另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的鏈稱為隨后鏈或隨從鏈(laggingstrand)。復制中的不連續(xù)片段（約1000個核苷酸）稱為岡崎片段(okazakifragments，1968)。

岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。2.鏈的延長：DNA聚合酶Ⅲ加入到引發(fā)體上，形成復制體，同時進行先導鏈和隨后鏈的合成。隨后鏈的合成不斷需要引物，引物酶合成引物，DNA聚合酶Ⅲ合成新的岡崎片段。3.前導鏈和隨后鏈協(xié)同合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引發(fā)體引發(fā)體解旋酶解旋酶4.去除引物，填補缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個磷酸酯鍵的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長。5.連接岡崎片段：在DNA連接酶的催化下，形成最后一個磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長鏈。

3‘5‘3‘5‘OHP原核生物基因是環(huán)狀DNA，大腸桿菌雙向復制的片段在復制的終止點(ter)處匯合。oriter

E.coli

ori

terSV40三）復制的終止

在ter區(qū)內存在７個ter序列（terA到terE），富含ＧＴ。其中terA、terＤ、terE位于復制叉匯合點的一側，terＣ、terＢ、terＦ、terＧ位于復制叉匯合點的另一側，它們分別是兩個復制叉終止的特異位點。每個復制叉必須越過另一個復制叉的終止位點才能到達自己的終止位點。Tus蛋白是解鏈酶的抑制劑，與ter位點結合終止復制。

DNA復制終止于ter區(qū)陷井區(qū)是終點利用物質（Tus）的結合部位。Tus可以和每一個ter結合。一旦形成Tus-ter復合物，就可以通過阻止解旋酶解旋DNA來封閉復制叉的通路。Tus-ter復合物只捕獲來自一個方向（順時針或反時針）的復制叉。DNA分配和細胞分裂期DNA合成期G1G2SM四、真核生物的DNA生物合成

?細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關鍵點。G1→S及G2→M的調節(jié)，與蛋白激酶活性有關。?蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子而實施調控作用。

合成機制與原核生物基本一致。間期間期復制所需蛋白質的合成?多起點的雙向復制：真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制子復制。果蠅最大的染色體至少有３０００個復制起點。?催化ＤＮＡ合成的DNA-pol不同。1、真核生物復制特點２．真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

具有引物酶活性和聚合酶活性，起始引發(fā)合成RNA引物及隨后鏈的復制。DNA-pol

ＤＮＡ修復作用。DNA-pol

線粒體DNA聚合酶。DNA-pol

具有聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。前導鏈和隨后鏈的復制。DNA-polε聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶至少有５種：第四節(jié)DNA損傷與修復DNADamageandRepair由于一些物理、化學或生物學因素的作用，或者由于生物體DNA復制過程出現(xiàn)異常均可引起DNA分子的損傷或改變。DNA核苷酸順序的永久性改變稱為突變。一、突變的意義1、突變是進化、分化的分子基礎2、突變導致基因型改變3、突變導致死亡4、突變是某些疾病的發(fā)病基礎生物進化中突變是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象。二、DNA損傷導致突變的幾種形式點突變：一個或少數(shù)幾個堿基的改變。插入突變：增加一個堿基對或多個堿基對的突變。缺失突變：缺失一個堿基對或多個堿基對的突變。倒位或轉位：DNA鏈重組使其中一段序列方向倒置、或從一處遷移到另一處。雙鏈斷裂:會導致細胞死亡。沉默突變：即同義突變，突變雖然替換了堿基，但氨基酸順序未變，保持野生型的功能。

回復突變：突變能克服第一次突變造成的影響。如點突變和插入突變往往是可逆的。鐮刀形紅細胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

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·

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·

pro·glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變三、引發(fā)突變的因素物理因素（紫外線(ultraviolet,UV)、電離輻射）和化學因素（化學誘變劑）等都能引起生物突變和致死。UV化學因素四、DNA損傷的修復修復(repairing)：是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使DNA恢復為正常的結構和功能。一個普通哺乳動物基因組在24小時之內可以積累成千上萬個DNA損傷，DNA修復系統(tǒng)的存在，避免了這種損傷對生命可能造成的巨大威脅。DNA修復系統(tǒng)具有多樣性，修復之所以成為可能，是因為DNA由兩條互補的雙鏈組成，當一條鏈損傷時，可以以另一條鏈做模板。一）在E.coli中存在6種基本的修復系統(tǒng)1.光修復2.切除修復3.錯配修復4.重組修復5.差錯傾向修復（SOS修復）1、光修復：紫外線可使DNA分子同一條鏈相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，從而影響復制和轉錄。DNA光復活酶能特異性識別嘧啶二聚體并與之結合，經(jīng)可見光照射后（波長約400nm）被激活，切除嘧啶二聚體間的c-c鍵，將二聚體分解為正常單體，酶從鏈上釋放，DNA恢復正常結構。光復活酶(photolyase)

UV2.切除修復

堿基切除修復：

DNA糖基化酶是一個能識別DNA中由胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤分別脫氨形成的損傷，并除去受損傷的堿基。這樣變型的堿基可以通過DNA糖基化酶切斷N-C糖苷鍵除去，在DNA中制造了脫嘌呤或脫嘧啶的部位，通常將這樣的部位稱之AP位點。每種DNA糖基化酶通常對一種類型的堿基損傷特異。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶，形成一個AP位點。然后一個稱為AP內切核酸酶切去含有AP位點的脫氧核糖-5-磷酸，出現(xiàn)一個核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一個正確的核苷酸，最后通過DNA連接酶將切口封閉。尿嘧啶糖基化酶系統(tǒng)的修復過程

核苷酸切除修復：

用以修復引起DNA雙螺旋結構變形的大的DNA損傷。修復酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分別編碼的三個亞基組成的，該酶又稱為ABC核酸酶。首先ABC切除核酸酶從損傷部位的兩側切去含有損傷的DNA鏈，結果都出現(xiàn)一個單鏈缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互補鏈填充缺口，切口最后通過DNA連接酶連接。UvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶ⅠOHPDNA連接酶ATP甲基指導的錯配修復3.錯配修復修復系統(tǒng)必須有一種區(qū)分模板鏈和新合成鏈的機制。細胞使用模板鏈的甲基化作用作為標簽，使它們和新合成鏈區(qū)分。Dam甲基化酶甲基化所有含有GATC順序中腺嘌呤N6的位置?？拷麲ATC順序附近的錯配可以根據(jù)已甲基化的模板鏈加以修復。切除的鏈可以長達離半甲基化的GATC順序遠至1000bp的錯配堿基。錯配可以通過E.coli中的3個蛋白質（MutS、MutH和MutL）校正。錯配修復

4.重組修復

切除修復發(fā)生在DNA復制之前，而當DNA復制時尚未修復的損傷部位，可以先復制，再重組修復。在重組修復過程中，DNA鏈的損傷并未除去。重組修復至少需要4種酶組分。重組基因recA編碼一種分