分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能(7-1)

分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

操作、設(shè)計(jì)與技能PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題及解決辦法李剛副教授標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

10×擴(kuò)增緩沖液10μl

4種dNTP混合物各200μmol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2μg

TaqDNA聚合酶2.5Unit

Mg2+

1.5mmol/L

加三蒸水或超純水至50μl。

PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間

一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

PCR反應(yīng)有哪些關(guān)鍵環(huán)節(jié)？

①模板核酸的制備；②引物的質(zhì)量與特異性；③酶的質(zhì)量；④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板最容易出現(xiàn)的問題一、模板含有雜質(zhì)：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定,不宜隨意更改。

二、模板發(fā)生變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時間過長（一般應(yīng)控制在1分鐘以內(nèi)）或無意中將模板置于超凈工作臺中滅菌所致。

PCR引物常見的問題引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

DNA聚合酶的問題酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時PCR失敗是由于忘加了酶。

Mg2+濃度Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。對于一些難以擴(kuò)增的模板，建議買PCRBuffer中Mg2+free的PCR試劑，以便自己通過一些預(yù)實(shí)驗(yàn)找出PCR反應(yīng)中最佳的Mg2+濃度。

PCR反應(yīng)體積通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個最簡單可行的辦法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產(chǎn)物匯集在一起。

退火溫度對PCR的影響退火溫度對PCR的擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。退火溫度可以用引物的Tm值-5度來粗略估計(jì)。但是精確的退火溫度必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定（可以使用梯度PCR儀）。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)（多用電子溫度計(jì)，帶有金屬傳感器探針）檢測一下擴(kuò)增儀內(nèi)的溫度控制是否準(zhǔn)確，這也是PCR失敗的原因之一。

PCR出現(xiàn)假陽性的原因？

假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。出現(xiàn)假陽性的原因主要有：

（1）引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。

（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，這種污染可以通過更換實(shí)驗(yàn)場地來解決，有時也可用巢式PCR方法來減輕或消除。

非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的原因

PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對策（一）其對策有：必要時重新設(shè)計(jì)引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(98℃變性，68℃左右退火與延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase就是采用的二溫度點(diǎn)法)。

非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對策（二）采用熱啟動PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對。熱啟動PCR則可以大大減少這些麻煩。其目標(biāo)是在第一個循環(huán)中等溫度升到超過反應(yīng)物的Tm值后才允許反應(yīng)中的一兩種關(guān)鍵成分進(jìn)入反應(yīng)。例如在復(fù)蓋有礦物油的小試驗(yàn)中，所有反應(yīng)管的一種公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一個循環(huán)的變性階段溫度超過80℃以后再加。最近有一種熱啟動的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體（Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶），在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反應(yīng)開始。非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對策（三）嵌套式和半嵌套式PCR對于減少或消除不需要的產(chǎn)物同時提高靈敏度經(jīng)常是很成功的。首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴(kuò)增，假象產(chǎn)物經(jīng)常會與引物中的一條或兩條配對，但其內(nèi)部卻是無關(guān)序列。接著對一部分反應(yīng)物－產(chǎn)物混合物進(jìn)行新一輪擴(kuò)增，采用的引物與第一對引物內(nèi)側(cè)的序列配對，在這一輪擴(kuò)增中只有真正的產(chǎn)物被擴(kuò)增。這種辦法即使在目的產(chǎn)物開始用EB染色檢測不到而且有假象帶時也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內(nèi)側(cè)，也同樣有效。在基因步行或企圖進(jìn)行5‘或3’端RACE時，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是已知的，經(jīng)常需要作這種變動。采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴(kuò)增在第20個循環(huán)左右終止而不是象通常的在第30－35個循環(huán)終止會獲得更好的結(jié)果，這樣做減少了產(chǎn)生不需要的高分子量帶和成片產(chǎn)物的機(jī)會。嵌套式PCR極端敏感，在106基因組DNA背景中一個拷貝的病毒基因也能檢測到。第二種形式的假象，即所謂的跳躍PCR，可能不能用嵌套式PCR消除。一些延伸不完全的產(chǎn)物可能偶爾與相鄰的DNA片段，也許是相似的基因成分重新配對，這樣會產(chǎn)生不需要的產(chǎn)物。在這種情況下，一條或兩條引物內(nèi)側(cè)的序列仍舊存在，但擴(kuò)增產(chǎn)物的大小不同。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當(dāng)降低Mg2+濃度；增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？

最佳插入片段：載體（常用T載體）比例需實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）是最常采用的比例。連接反應(yīng)通常室溫下保溫1小時即可，如有必要，也可4℃（16℃）過夜。在這2種溫度下，無插入片段的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。而帶有插入片段的載體則產(chǎn)生白斑。使用TA克隆方法或平端連接方法（采用高保真DNA聚合酶如Pfu擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平末端，此時可利用pUC19載體上的SmaI位點(diǎn)連接PCR產(chǎn)物或采用平端的PCR產(chǎn)物克隆載體）。

PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體或其它非特異性條帶。為此需在克隆前做凝膠純化（即切膠回收目的條帶）。

PCR出現(xiàn)smear可能的原因（1）

Smear，也稱彌散帶、片狀拖帶或涂抹帶。都是由于產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增所致，需要逐個驗(yàn)證：

1、酶、dNTP、引物、模板濃度太大?？梢詼p少這幾個組分的用量。

2、退火溫度太低。需要升高退火溫度，可以先做一個不同溫度的預(yù)實(shí)驗(yàn)或者選用降落PCR。

3、引物特異性不好。引物特異性的好壞可以通過引物設(shè)計(jì)軟件分析，也可以在ncbi比對得知。關(guān)于引物是否合成的好，可以電泳看一下。如果只有一條清晰的帶就可以了。如果合成的不好，產(chǎn)物自然不特異了，就很容易產(chǎn)生smear。

4、Mg2+濃度的問題。這個成分對產(chǎn)物的特異性是非常重要的，可以做一個梯度實(shí)驗(yàn)優(yōu)化一下。

PCR出現(xiàn)Smear的可能原因（2）假定使用了比較好的Taq酶，且引物沒有出現(xiàn)問題，可再考慮如下幾點(diǎn)：

1、模板是否過量？

2、退火溫度是否可升高1－2度？

3、Mg2＋的濃度是否控制在1.5mM左右?

4、循環(huán)數(shù)是否過多？

進(jìn)行多輪PCR時，PCR產(chǎn)物

成片的原因?進(jìn)行多輪PCR時，如果下一輪PCR反應(yīng)的起始模板量太大，即使PCR條件是正常的，產(chǎn)物成片現(xiàn)象也可能會出現(xiàn)?？偟囊?guī)則是如果上一輪PCR產(chǎn)物在凝膠上見得到條帶，只能用1l上一輪PCR產(chǎn)物的1：104到1：105稀釋物作為模板進(jìn)行下一輪PCR。另外對上一輪PCR產(chǎn)物稀釋也降低了下一輪PCR產(chǎn)物出錯的概率。很少或沒有檢測到產(chǎn)物的原因如果已經(jīng)調(diào)整了Mg2＋濃度、緩沖液的pH值和循環(huán)產(chǎn)物，而且也增加了循環(huán)數(shù)，嘗試過了較低的退化溫度和TDPCR，但在EB染色的凝膠上還是看不到產(chǎn)物（聚丙烯酰胺凝膠比瓊脂糖凝膠要敏感一些），而陽性對照表明試劑沒有問題，下一步該怎么辦？延長起始的變性時間和（或）提高溫度能增加模板DNA完全變性的可能，以提供最大數(shù)量的引物配對位點(diǎn)。這一可選步驟的標(biāo)準(zhǔn)條件是95C變性5分鐘，有可能擴(kuò)增發(fā)生了，只是效率不高，如果這樣，可通過對干凝膠或印跡的雜交來檢測產(chǎn)物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增，有可能得到特異產(chǎn)物，這時必須用第一次PCR產(chǎn)物的從1：100到1：10000的一系列10倍稀釋物。很少或沒有產(chǎn)物可能提示DNA樣品中存在抑制物。許多PCR的抑制物已被描述過，它們包括離子性去污劑（如SDS）、酚、肝素等。通過