第四章 性別控制技術(shù)

性別控制定義性別控制技術(shù)概況性別控制的意義性別控制的方法性別控制技術(shù)前景第四章性別控制畜牧生產(chǎn)中，肉、奶、蛋等重要經(jīng)濟性狀在性別間有差異，有的是限性性狀。奶牛蛋雞長毛兔：產(chǎn)毛量母兔優(yōu)于公兔一、性別控制定義一、性別控制定義在正常情況下，自然界動物群體公、母性別比例基本上近于1:1，保持性別比例平衡是生物進化的結(jié)果。性別控制(sexcontrol，SC)指通過人為干預(yù)并按人們的愿望使雌性動物繁殖出所需性別后代的一種繁殖新技術(shù)。二、性別控制技術(shù)的發(fā)展概況20世紀(jì)初，McChung(1902)在研究蝗蟲精細(xì)胞時，首先提出了性別決定的染色體理論。此后，Stevens和Wilson用昆蟲進行一系列研究后指出，雌雄個體中不同的性染色體與性別有關(guān)，并將性染色體定義為X染色體和Y染色體。隨后，許多研究證實，哺乳動物的正常性別是由一對性染色體決定的。動物個體的性別取決于受精時雌、雄配子所攜帶的性染色體類別。1923年，Painter證實了人類X和Y染色體的存在，指出當(dāng)卵子與X精子受精，后代為雌性，與Y精子受精，后代為雄性。1955年Eichwald和Silmser發(fā)現(xiàn)雄性特異性弱組織相容性抗原（malespecificminorhistocompatibility-Yantigen,H-Y抗原）后，許多人致力于用H-Y抗體來控制動物性別，但后來通過其他方法驗證的結(jié)果，用H-Y抗體來分離X和Y精子及胚胎性別鑒定都不理想。近交系小鼠性別間皮膚移植實驗：雄性雄性、雌性雌性、雌性雄性均不發(fā)生排斥反應(yīng)。雄性雌性時出現(xiàn)了排斥反應(yīng)。表明雄鼠皮植片具有一種雄性特有的細(xì)胞表面成分。這種成分被稱為雄性特異性次要組織相容性Y抗原（malespecificminorhisticmpatibility-Yantigen），簡稱H-Y抗原。1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色體決定雄性的理論，引起了人們從染色體上尋找性別決定基因。1966年，Jacobs等發(fā)現(xiàn)雄性決定因子位于Y染色體短臂上1989年，Palmer等找到了Y染色體上的性別決定區(qū)(sexdeterminingregionoftheYchromosome，SRY)，它的長度為35kb，編碼79個氨基酸，在不同哺乳動物中有很強的同源性。SRY序列的發(fā)現(xiàn)是哺乳動物性別決定理論的重大突破。目前，用分子生物學(xué)方法確定胚胎細(xì)胞中是否存在SRY基因來鑒定胚胎性別的技術(shù)已進入實際應(yīng)用階段。三、性別控制的意義目的是在動物出生前即用人工方法控制其性別，以改變后代的自然性別比例，進而按照人們的意愿進行特定性別的畜禽生產(chǎn)，顯著提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益。對高效優(yōu)質(zhì)的發(fā)展畜牧業(yè)具有重要意義可使受性別限制的生產(chǎn)性狀（如泌乳性狀）和受性別影響的生產(chǎn)性狀（如肉用、毛用性狀等）能獲得更大的經(jīng)濟效益；可增強良種選育中的選擇強度，加快遺傳改良的進度；可以排除畜群中有害基因或不理想的基因（如避免患有伴性遺傳疾病后代的出生）。四、性別控制的方法主要兩方面，一是受精之前，二是受精之后。受精前的性別控制胚胎的性別鑒定胎兒出生前的性別鑒定生物技術(shù)（一）受精前的性別控制精子的分離調(diào)節(jié)授精環(huán)境的pH值控制授精時間哺乳動物精子可分為兩類，一類攜帶X染色體(X精子)，一類攜帶Y染色體(Y精子)。

這兩類精子在比重、體積、表面電荷、表面抗原等方面略有差異。根據(jù)這些差異，設(shè)計了諸如沉降法、離心法、過濾法、電泳法、H-Y抗原法等分離方法試圖將這兩類精子分開，達到控制后代性別比例的目的。精子的分離X、Y精子分記方法的發(fā)展物理分離法免疫分離法流式細(xì)胞分離法物理分離法沉積分離法電泳法層流分離法白蛋白液柱分離法傳遞逆流電流法Y精子F小體檢測物理分離法（1）沉積分離法：根據(jù)X精子比Y精子稍重，故沉降速率稍快。電泳法：X精子帶有較多的凈負(fù)電荷，因此，X精子向正極移動的速度比Y精子快。層流分離法：根據(jù)X精子和Y精子具有不同的游動方式和行為來分離精子，X精子集中在液柱的始端而Y精子集中在較遠(yuǎn)的一端。物理分離法（2）白蛋白液柱分離法：在粘滯的白蛋白液柱中，Y精子的游動速率比X精子快。傳遞逆流電流法：用熱傳遞和逆流沉積法結(jié)合電流的方法來分離人精子。比較輕的Y精子移動緩慢，從而分別收集到X和Y精子。物理分離法（3）Y精子F小體檢測對男性染色體染色，發(fā)現(xiàn)Y染色體長臂發(fā)出熒光比其他染色體強，并且，在分裂期間細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)很量的斑點（F小體）。39%-47%人精子呈現(xiàn)F小體。F小體并非在全部哺乳動物中見到，但在大猩猩和家畜精子中均發(fā)現(xiàn)了F小體，因此可用于家畜精子分離。免疫親和柱層析法H-Y抗血清直接輸入法免疫磁珠技術(shù)免疫學(xué)分離法1、免疫親和柱層析法

用這種方法分離小鼠精子進行人工授精，發(fā)現(xiàn)H-Y-組獲得4.2%的雄鼠（對照組為46.6%），H-Y+組獲得92%的雄鼠。

2、H-Y抗血清直接輸入法

Zavos等（1983）給家兔陰道輸入H-Y抗血清，15min后進行人工授精，獲得了74%的雌性仔兔；未輸入H-Y抗血清的對照組，雌兔率為44.4%。

3、免疫磁珠技術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是近年迅速發(fā)展起來的細(xì)胞或細(xì)胞顆粒定量分析和進行細(xì)胞分類研究的新技術(shù)。流式細(xì)胞儀（flowcytometer）又稱熒光激活細(xì)胞分類器（FACS）是流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計算機技術(shù)綜合性的高科技產(chǎn)品。流式細(xì)胞分離法主要組件：液流系統(tǒng)、激光器、熒光檢測器、散射光檢測器、偏轉(zhuǎn)板、細(xì)胞收集器以及電子控制系統(tǒng)和計算機系統(tǒng)。這種分類技術(shù)可以測定細(xì)胞的大小、數(shù)量和類型，并可依賴熒光染色測定DNA含量和蛋白質(zhì)水平，同時根據(jù)其差異進行分離。流式細(xì)胞分離法理論基礎(chǔ)：X精子DNA含量比Y精子多（人：差異為2.8％，家畜：差異3.0％～4.2％）。將精子稀釋并與熒光染料Hoechst33342共培養(yǎng)，染料定量結(jié)合DNA。當(dāng)精子通過檢索儀時被定位從而被激光束激發(fā)，X精子放射出較強的熒光信號,通過儀器和計算機系統(tǒng)擴增、分析并分辨出X精子與Y精子。該法所獲得的首例成活后代是經(jīng)子宮內(nèi)手術(shù)授精出生的兔子。英國劍橋動物生物有限公司最早于1993年開展用分離精子進行牛IVF研究并獲得成功。分離精子的速度很慢相對于人工授精的輸精量（一千萬個精子）而言，它的分離速度太慢，每小時只能分離35萬個精子（2001年數(shù)據(jù)）。流式細(xì)胞分離法受胎率低精子受精力比正常精子低，解凍后的活力和頂體完整率低等。分離過程不會影響受精，但可能會影響早期胚胎和胎兒的發(fā)育。原因：熒光染色、稀釋、冷凍、分離前后的保存、分離過程中紫外線的照射及機械損傷等，都可能會對精子產(chǎn)生不利影響?，F(xiàn)已證實，分離過程會損傷精子細(xì)胞膜，使活力、存儲能力和受精能力下降。精液在分離過程中的高倍稀釋，會使精子活力下降。而分離前洗脫精漿、稀釋和分離都會降低精子質(zhì)膜的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致提前獲能。雖然質(zhì)膜穩(wěn)定性降低可使精子能夠馬上具有受精能力，能立刻用于體外受精，但另一方面卻縮短了精子壽命，使得精子在到達受精部位前或在體外保存過程中死亡。價格昂貴每臺約25萬美元。流式細(xì)胞分離法發(fā)展前景隨著分離精子速度的提高，將來可以提供足夠數(shù)量的用于人工授精的分離精子。例如，Beltsville公司利用新型的精子分離專用噴嘴來提高精子分離速度。在分離純度為90％時，每小時可分離精子6百萬個；如果純度只是要求在75％～80％，那么速度可達到每小時2千萬個。另一方面，由于精子分離速度慢、成本高，人們一直探討采用只需少量精子的輸精技術(shù)。如手術(shù)輸精（子宮內(nèi)、輸卵管內(nèi)）、人工授精（子宮深部、子宮頸部）、體外受精（IVF）和胞質(zhì)內(nèi)精子注射（ICSI）。調(diào)節(jié)授精環(huán)境的pH值Ｙ精子對疲勞和酸的耐受力較差。向前等(1996)用pH7.2的精液人工授精，結(jié)果產(chǎn)公犢72.3%，pH6.8產(chǎn)公犢39.1%。段恩奎等(1991)在兔輸精前經(jīng)陰道輸入不同濃度和構(gòu)型精氨酸改變生殖道pH，結(jié)果后代雌性比率與濃度無關(guān)，而與pH有關(guān)，pH5.22雌兔率為39.1%，pH9.83雌兔率為61.90%,但與正常性比率差異不顯著。近幾年來，有許多人做此方面的實驗，有成功的報道，也有否定的觀點。控制授精時間母牛排卵前輸精易得雌性后代，近排卵時易得雄性后代，預(yù)測和實際符合率70%。豬：對22窩母豬試驗，排卵前授精得母仔55.6%，排卵后授精得公仔57.3%，（P<0.05）。排卵前E2、LH比排卵后高2.3、6.3倍。改變凍精的解凍溫度在一定溫度范圍內(nèi)，冷凍精液的解凍溫度與精子的活力呈正相關(guān)。凍精解凍溫度越高，精子復(fù)活越快，其活力也越強，消耗的能量快而多，故存活時間短。這樣相應(yīng)的縮短了Y精子的壽命，而延長了X精子的壽命，并增加了與卵子結(jié)合的機會，從而提高生母率。（二）胚胎的性別鑒定性染色質(zhì)鑒定法染色體組型鑒定法Ｘ連鎖酶活力測定法雄性特異抗原鑒定法SRY-PCR鑒定法LAMP早期胚胎分割方法毛細(xì)管吹吸法2到8-細(xì)胞期卵裂球（有的是16細(xì)胞，應(yīng)在致密化之前）顯微手術(shù)法取囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞或桑椹胚部分細(xì)胞玻璃針、顯微手術(shù)刀顯微操作儀簡介胚胎分割1(模式:桑椹胚/囊胚)胚胎分割2（2-到8-細(xì)胞期卵裂球）注：兩部片子中都不是太確切。應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對早期胚胎進行快速、準(zhǔn)確的性別鑒定是可行的，但由于早期胚胎性別鑒定需從胚胎上取下少量細(xì)胞，對胚胎有一定損害，經(jīng)冷凍-解凍處理后僅有少量胚胎存活，導(dǎo)致胚胎移植的成功率下降，這就制約了提供預(yù)知性別家畜胚胎的商業(yè)化進程。1、性染色質(zhì)鑒定法是世界上第一種鑒定胚胎性別的方法。Garner等人于1968年從兔胚胎中取出細(xì)胞并對其性染色質(zhì)或染色質(zhì)小體進行分析。此法較復(fù)雜且對胚胎損傷大，成功率甚低，同時染色質(zhì)小體在許多家畜胚胎細(xì)胞中很難發(fā)現(xiàn)和觀察。對那些可辨認(rèn)性染色質(zhì)(暫時失活的X染色體)的少數(shù)胚胎來說，準(zhǔn)確性很高。在實際生產(chǎn)中沒有多大的價值。2、染色體組型鑒定法經(jīng)典胚胎性別鑒定方法。(1)采集胚胎細(xì)胞樣品；(2)專門訓(xùn)練有素的技術(shù)人員；(3)費時。2名有經(jīng)驗的技術(shù)人員約需5小時才能鑒定12-15枚胚胎。難以應(yīng)用于生產(chǎn)之中，只能主要用來驗證其它性別鑒定方法的準(zhǔn)確率。操作過程:先取少量的胚胎細(xì)胞，在含有秋水仙素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使細(xì)胞的有絲分裂停留在中期；用低滲溶液使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜破裂釋放染色體，然后固定，用姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察。由于有絲分裂被阻滯在中期，故染色體縮短，形狀規(guī)則，并有特異的帶型。通過核型分析來鑒定胚胎性別，尋找不能與X性染色體配對的Y染色體。準(zhǔn)確率幾乎是100%3、Ｘ連鎖酶活力測定法原理：早期雌胚中2條Ｘ染色體中的一條失活，在胚胎基因組激活與Ｘ染色體失活的短暫時期內(nèi)，2條Ｘ染色體均可被轉(zhuǎn)移，雌胚中與Ｘ關(guān)聯(lián)酶濃度及活性為雄胚的2倍。小鼠8-細(xì)胞胚次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，結(jié)果14/15的胚胎性別與HPRT活性結(jié)果一致，其中雄性準(zhǔn)確率100%，雌性91%。測定從桑椹胚到囊胚階段小鼠胚胎6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PP)的活性，雌性準(zhǔn)確率為72%，雄性57%。對Ｘ染色體失活時間尚不明確,易誤判。4、Ｈ-Ｙ抗原鑒定法胚胎的細(xì)胞毒性分析胚胎H-Y抗原的間接免疫熒光分析法囊胚形成抑制法4.1胚胎細(xì)胞毒性分析原理：在補體存在的情況下，H-Y抗體可以與H-Y+胚結(jié)合使其中1個或多個卵裂球溶解，或使卵裂球不規(guī)則，阻滯了胚胎的發(fā)育。將正常胚胎移植給同期化受體，所生仔鼠有86%為雌性。以破壞胚胎為代價，近年來已很少采用。

4.2間接免疫熒光分析法原理：以H-Y抗體作為一抗，二抗為山羊抗鼠IgG/FITC，依次與胚胎共培養(yǎng)。對胚胎無損害性。判為雄胚者有78%產(chǎn)雄鼠，判為雌胚者有81%產(chǎn)雌鼠。在牛有83%-89%的雌性鑒定準(zhǔn)確率，豬為81%的鑒定準(zhǔn)確率，綿羊為85%的準(zhǔn)確率。

4.3囊胚形成抑制法原理：H-Y抗體可逆性抑制囊胚形成，與桑葚胚共培養(yǎng)，雌胚繼續(xù)發(fā)育形成囊胚。雄胚洗去H-Y抗體，繼續(xù)培養(yǎng)。胚胎移植后的存活力與正常胚無異，實用。雌胚移植后產(chǎn)生79.1%（38/48）的雌鼠，雄胚移植后產(chǎn)生91.3%（21/23）的雄鼠。Utsumi等（1993）用含大鼠H-Y抗體的培養(yǎng)液培養(yǎng)牛桑葚胚，核型分析證明，判為雌胚者80%-90%具XX核型，判為雄胚者80%具XY核型。

5、SRY-PCR鑒定法原理：利用雄性特異性基因探針和PCR。優(yōu)點：對胚胎損害??；準(zhǔn)確率較高，可達90%以上。方法：取少量胚胎細(xì)胞，使其DNA與已知為Ｙ染色體特異標(biāo)記的互補DNA序列雜交，陽性胚為雄性，反之為雌性。犢牛雄性準(zhǔn)確率95%，雌性準(zhǔn)確率為93%。通過PCR擴增Ｙ染色體的特異性重復(fù)序列或SRY基因可大大增加鑒定的靈敏度、改善準(zhǔn)確度。（三）胎兒出生前的性別鑒定在著床后某個階段檢測胎兒的性別，然后選擇性的流產(chǎn)B型超聲波：檢測有無陰囊（人）/GT位置羊水穿刺術(shù)：測定羊水激素（睪丸酮）含量，分析染色體，用Ｙ染色體特異性DNA探針檢測從羊水中獲得的細(xì)胞，以確定性別。

（四）生物技術(shù)克?。杭春艘浦病Ｓ靡阎詣e的細(xì)胞作供體，移入去核的卵母細(xì)胞中，從而發(fā)育成新個體。胚胎分割：先鑒定胚胎的性別，然后胚胎分割，將分割后的胚胎培養(yǎng)后移植到受體獲得多個相同性別的新個體)。顯微受精：給卵子注射經(jīng)性別鑒定的精子。孤雌生殖：哺乳類動物已實現(xiàn)人工孤雌生殖五、性別控制技術(shù)前景

迄今為止，性別控制最成功的方法是流式細(xì)胞器分離X精子和Y精子法和胚胎SRY-PCR擴增法。前者由于分離速度較慢、精子活率較低，影響人工輸精后的受胎率，故亟待解決這兩種問題以滿足人工輸精的要求。SRY-PCR技術(shù)鑒定胚胎性別的方法尚需解決提高靈敏度和縮短鑒定時間的問題，加緊研制出各種家畜胚胎性別鑒定的SRY-PCR試劑盒，使這種方法的操作簡單而實用。性別控制對人類和動物尤其是家畜的育種和生產(chǎn)有著深遠(yuǎn)的意義。在生產(chǎn)上，奶牛場主希望從其優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的核心群中繁殖出更多的小母牛來更新奶牛群；而肉用牛場主則希望繁殖出更多的小公牛，因為公牛生長速度比母牛快，而且閹公牛肉的價格較高。對后裔測定來說，性別控制比無性別控制至少可以節(jié)省一半的時間、精力和費用。對人類來說，通過性別控制可以避免因出生與X相關(guān)隱性疾病的嬰兒而造成的痛苦，如囊性纖維化（cysticfiro