第五章親和層析分離技術(shù)

第五章親和層析技術(shù)北京化工大學(xué)譚天偉教授親和層析技術(shù)5.1簡介5.2親和層析理論5.3親和層析介質(zhì)活化5.4常見底親和層析技術(shù)利用生物大分子之間的專一性識別性或特定的相互作用的分離技術(shù)稱為親和層析分離技術(shù)5.1簡介簡介——親和配基單專一性的小分子配基基團專一性小分子親和配基專一性的大分子親和配基免疫親和配基基因?qū)Ｒ恍缘拇蠓肿佑H和配基參數(shù)生物專一性（AC）擬生物專一性配基親和層析IMACDLACHLAC專一性很高較高中等較高，取決于吸附條件配基交聯(lián)技術(shù)很多環(huán)氧化物直接吸附或?qū)ρ趸锝馕y易中等容易化學(xué)交聯(lián)容易容易吸附容量低，0.1-1.0%配基利用高高中等再生及穩(wěn)定性較差，易變性高高高，可用濃或處理成本高較低最低較低不同親和層析分離方法的比較簡介——親和洗脫

親和洗脫是和親和吸附（AffinityAdsorption）對應(yīng)的，即利用在洗脫液中加入和吸附目標(biāo)蛋白有專一性的物質(zhì)，而只將目標(biāo)分子解吸下來。親和洗脫可用于親和層吸，也可以用于普通的層析如離子交換等的解吸。親和洗脫一般采用和目標(biāo)分子具有識別性的小分子或類似物。親和層析分離技術(shù)親和層析的理論親和介質(zhì)的制備常見的親和層析5.2親和層析的理論當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在非凝膠相和凝膠相之間達到平衡親和層析的理論對正常的凝膠過濾色譜而言親和色譜中，固定配基在蛋白和凝膠之間產(chǎn)生的額外親和作用親和層析的理論實際上，Ve’/Ve很難測定，但在洗脫液中，加入可活性配基或競爭性抑制劑，使固定配基的表邊的親和力降低，其數(shù)值可以測得親和層析的理論推導(dǎo)得到在可溶性親和競爭性配基的存在下，固定配基對酶的阻滯作用降低，其程度取決于可溶性配基和固定配基的相對濃度和解離常數(shù)。親和層析的理論5.3親和介質(zhì)的制備介質(zhì)的選擇介質(zhì)的活化和偶聯(lián)親和配基固定偶聯(lián)的密度的測定間臂分子的選擇介質(zhì)的選擇通常而言，親和色譜的介質(zhì)應(yīng)具備下面四個條件：

具有多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)非特異吸附小，基質(zhì)化學(xué)性質(zhì)應(yīng)是惰性，表面電荷盡可能低；理化性質(zhì)穩(wěn)定，不因共價偶聯(lián)反應(yīng)的條件及吸附條件的變化而發(fā)生變化；基質(zhì)必須能夠活化或功能化介質(zhì)是親和配基附著的基礎(chǔ)，起著支撐和骨架作用介質(zhì)的選擇多糖類：

纖維素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）

瓊脂糖（agarose）

聚丙烯酰胺無機基質(zhì)

可控制孔徑多孔玻璃（CPG）、

陶瓷和硅膠介質(zhì)的選擇用于分析時，專一性比容量及穩(wěn)定性重要，而應(yīng)用制備時，吸附劑的穩(wěn)定性是最主要的指標(biāo)，同時還要考慮成本因素。對于不同的介質(zhì)而言，這些要求不可能同時滿足。所以在介質(zhì)的選取時，應(yīng)該根據(jù)具體的分離要求選擇合適的介質(zhì)。專一性（Specifcity）、容量（capacity）及穩(wěn)定性（stability）是衡量所選介質(zhì)好壞的三個標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)的活化和偶聯(lián)介質(zhì)的活化和偶聯(lián)多糖基質(zhì)

溴化氰法，三嗪法高碘酸鹽法環(huán)氧化物法苯醌法其他活化劑聚丙烯酰胺基質(zhì)

戊二醛法肼法多孔玻璃與硅膠溴化氰法多糖基質(zhì)三嗪法多糖基質(zhì)高碘酸鹽法多糖基質(zhì)環(huán)氧化物法多糖基質(zhì)苯醌法多糖基質(zhì)其他方法——甲苯磺酰氯多糖基質(zhì)戊二醛法聚丙烯酰胺基質(zhì)聚丙烯酰胺基質(zhì)肼法多孔玻璃與硅膠親和配基固定偶聯(lián)的密度的測定分光光度法重量差法分析水解作用分析元素分析法間臂分子的選擇由于生物大分子的空間結(jié)構(gòu)及層析介質(zhì)本身孔結(jié)構(gòu)的因素，往往在配基和基質(zhì)骨架之間引入一個間臂分子，可顯著地提高配基的空間利用度，即提高吸附容量。間臂分子的引入時要考慮兩個因素：空間位阻，疏水作用5.4常見的親和層析核苷酸及輔酶和層析固定化金屬離子親和層析染料親和層析免疫親和層析基團專一性大分子親和層析共價色譜常見的核苷酸及輔酶親和層析介質(zhì)配基分類配基生產(chǎn)公司典型應(yīng)用腺苷腺苷3’，5’－環(huán)化單磷酸（CAMP）PLBiochemicalSIGMA腺苷激酶及脫氨酸腺苷－3’，5’二磷酸（3’，5’－ADP）PLBiochemicalSIGMAPharmcia依賴輔酶A的酶腺苷－5’－單磷酸（AMP）PLBiochemical磷酸化酶腺苷－5’－三磷酸（AIP）PLBiochemical激酶輔酶輔酶A（CoA）PLBiochemicalCoA轉(zhuǎn)移酶，乙酸-CoA酶氧化型輔酶I（NAD＋）PLBiochemicalSIGMA5-核苷酸酶氧化型輔酶Ⅱ（NADP＋）PLBiochemical核酸酶核苷酸鳥苷-5’-三磷酸SIGMA谷氨酸脫氫酶5.4.1

核苷酸及輔酶親和層析N6（6-氨己基）氨甲酰-AMP-Sepharose間接偶聯(lián)法示意圖核苷酸及輔酶親和層析核苷酸及輔酶親和層析核苷酸親和層析的合成

碳二亞胺直接法偶聯(lián)間接偶聯(lián)法

核苷酸親和層析的吸附和解吸5.4.2

固定化金屬離子親和層析螯和基團和金屬離子的選擇親和層析介質(zhì)的合成固定化金屬離子親和層析的吸附和解吸條件5.4.3

染料親和層析染料親和層析介質(zhì)的制備蛋白質(zhì)的吸附和解吸染料親和層析CibacronBlueF3G-A結(jié)構(gòu)圖其中R為:染料親和層析ProcionRedH-E3B結(jié)構(gòu)圖染料配基和蛋白質(zhì)作用大小排列第一組第二組第三組第四組第五組ProcionBlueMX-7RXCibacronBlue2-RAProcionYellowMX-6GRemazolOrgane3RCibacronBrown3-GRAProcionRedMX-4RProcionYellowMX-4RRemazolOrganeRCibacronBlueF3-GAProcionRedH-E3GRemazolBlueRProcionYellowH-E6RProcionBlueMXGProcionOrgangeMX-2RProcionRedMX-7BProcionblueH-ERDProcionGreenH-E4BDProcionRedH-3B染料親和層析5.4.4免疫親和層析免疫親和層析介質(zhì)的制備免疫親和層析的吸附和解吸比較項目單抗多抗設(shè)備需求多簡單手工時間多少抗體數(shù)量大中等提供的持久性長期短抗體質(zhì)量高低親和專一性可高可低多數(shù)專一性高免疫親和層析單抗和多抗的比較5.4.5

基團專一性大分子親和層析ProteinA親和層析

IgG抗體解吸：1Macetatebuffer0.1MglyceicineHClbufferConA親和層析

糖蛋白：免疫球蛋白，IgM

低密度酯蛋白肝素親和層析原理（a）吸附過程；（b）洗脫過程；（c）再生過程5.4.6

共價色譜引入硫醇基引入雙硫鍵

共價介質(zhì)的合成共價色譜的吸附和解吸1、上樣預(yù)處理2、吸附

吸附時間較長，柱子長度檢測3、解吸

10－25mMDTT（二