干擾素制備的工藝流程

干擾素制備的工藝流程第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日什么是干擾素？概念(interferon,IFN)：機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時，免疫細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日α干擾素又依其結(jié)構(gòu)分為α1b、α2a、α2b等亞型其區(qū)別在于個別氨基酸的差異上，早期干擾素是用病毒誘導(dǎo)人白血球產(chǎn)生的，產(chǎn)量低、價格昂貴，不能滿足需要，現(xiàn)在可利用基因工程技術(shù)并在大腸桿菌中發(fā)酵、表達(dá)來進(jìn)行生產(chǎn)。第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日目的基因的分離克隆載體目的基因與克隆載體的體外重組→重組體導(dǎo)入大腸桿菌K12→受體菌的培養(yǎng)及篩選→從受體菌中獲取目的基因表達(dá)載體重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌受體菌的篩選，表達(dá)性、穩(wěn)定性等檢測工程菌→基因工程菌的制備第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日一、目的基因的分離與獲得1.設(shè)計合成干擾素基因的兩端引物（完全的），每條引物內(nèi)或5`-端最好有內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。2.藥物誘導(dǎo)細(xì)胞，如佛波酯，使細(xì)胞表達(dá)干擾素升高。3.破碎細(xì)胞，提取細(xì)胞總mRNA.4.用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，把總mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA5.以cDNA為模板、干擾素引物為引物，PCR，得到完全的干擾素基因的PCR產(chǎn)物第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日二、目的基因與克隆載體進(jìn)行體外重組1.提取載體（質(zhì)粒、病毒等），雙酶切，再把干擾素基因的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的酶酶切，用連接酶連接EcoRIBamHIEcoRIBamHI2.連接完成后分離純化，測序，與原干擾素序列比對。3.鑒定序列無誤后（無義突變也行），導(dǎo)入受體細(xì)胞，篩選第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日三、重組體引入宿主細(xì)胞

將cDNA克隆到含有四環(huán)素、氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pBR322中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，重組的載體DNA分子在一定條件下轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，形成攜帶質(zhì)粒的菌株。第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日四、從大腸桿菌k12獲取目的基因

由于質(zhì)粒重組時有3種基本方式，即：目的基因與克隆載體重組，目的基因片段與目的基因片段重組，克隆載體與克隆載體重組；另外重組過程可能會發(fā)生基因突變情況流程：步驟一：將細(xì)菌涂布到含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，就可得到質(zhì)粒PBR322或重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落。步驟二：步驟一獲得的每一個細(xì)菌單菌落標(biāo)記為a、b、c、d等，在每一個單菌落中挑取部分細(xì)菌轉(zhuǎn)涂到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，不能生長的是絕大部分含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌及少量可能發(fā)生突變的非重組質(zhì)粒的細(xì)菌單菌落。原因：因?yàn)镻BR322含有抗四環(huán)素基因，重組質(zhì)粒中目的基因插在抗四環(huán)素基因中，使其結(jié)構(gòu)破壞，失去抗四環(huán)素作用。第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日五、提取重組質(zhì)粒1、對上一步獲得含目的基因的大腸桿菌在含有氯霉素的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)15h。培養(yǎng)時間：前人實(shí)驗(yàn)證實(shí)大腸桿菌K12生長前6h為遲緩期,6~15.5h為對數(shù)增時期,15.5~19.5h為穩(wěn)定期,19.5h后為衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制。2、細(xì)菌的收獲和裂解

１）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。

第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日２）將細(xì)菌沉淀重懸于100ml用冰預(yù)冷的STE中。

STE

0.1mol/LNaCl

10mmol/LTris.Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)

按步驟１）所述方法離心，以收集細(xì)菌細(xì)胞。3、堿裂解法

１）將冼過的500ml培養(yǎng)物的細(xì)菌沉淀物[來自收獲細(xì)菌的步驟3]重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。

溶液Ｉ:

50mmol/L葡萄糖

25mmol/LTris.Cl(pH8.0)

10mmol/LEDTA(pH8.0)

溶液Ｉ可成批配制，在10lbf/in2(6.895x104Pa)高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于４℃。

第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/LTris.Cl(pH8.0)]。當(dāng)溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。

３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。

溶液Ⅱ:

0.2mol/LNaOH(臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）

1％SDS

蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物。于室溫放置5-10分鐘。４）加15nl(20ml)用冰預(yù)冷的溶液Ⅲ。

溶液Ⅲ:

5mol/L乙酸鉀60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日所配成的溶液對鉀是３mol/L，對乙酸根是5mol/L。

封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內(nèi)容物，此時應(yīng)不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應(yīng)形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應(yīng)包括染體DNA、高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質(zhì)－膜復(fù)合物５）用合適轉(zhuǎn)頭于4℃以4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，不開剎車而使轉(zhuǎn)頭自然停轉(zhuǎn)。如果細(xì)菌碎片貼壁不緊，可以5000轉(zhuǎn)/分再度離心20分鐘，然后盡可能將上清全部轉(zhuǎn)到另一瓶中，棄去殘留在離心管內(nèi)的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細(xì)菌裂解物混合不充分第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日６）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。７）用合適轉(zhuǎn)頭于室溫以500轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。８）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮殆盡。９）用3mlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）純化。第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日六、質(zhì)粒DNA的純化

（一）聚乙二醇沉淀法提取質(zhì)粒ＤＮＡ

１）將核酸溶液所得]轉(zhuǎn)入15mlＣorex管中，再加3ml用冰預(yù)冷的5mol/LLiCl溶液，充分混勻，用合適轉(zhuǎn)頭于４℃下以10000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。

２）將上清轉(zhuǎn)移到另一30mlCorex管內(nèi)，加等量的異丙醇，充分混勻，用SorvallSS34轉(zhuǎn)頭（或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)尖）于室溫以10000轉(zhuǎn)/分離心10分釧，回收沉淀的核酸。

３）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使最后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使最后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

４）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。

第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日５）加500μl含13％（w/v)聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl,充分混合，用微量離心機(jī)于４℃以12000g離心５分鐘，以回收質(zhì)粒ＤＮＡ。

６）吸出上清，用400μlTE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽１次。

７）將水相轉(zhuǎn)到另一微量離心管中，加100μl10mol/L乙醇銨，充分混勻，加２倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12000g離心5分鐘，以回收沉淀的質(zhì)粒ＤＮＡ。

８）吸去上清，加200μl處于4℃以12000g離心2分鐘。

９）吸去上清，敞開管口，將管置于實(shí)驗(yàn)桌上直到最后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

10）用500μlTE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0)]后測量OD260，計算質(zhì)粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質(zhì)粒DNA/ml），然后將DNA貯于－20℃。第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日七、對重組質(zhì)粒的檢測與目的基因提取目的基因獲取對獲得的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，獲得目的基因與PBR322質(zhì)粒片段，通過瓊脂糖凝膠電泳，由于目的基因與PBR322質(zhì)粒片段相對分子量不同，在電泳過程中產(chǎn)生不同的條帶，通過與已知基因長度的對比，我們可以選出相應(yīng)的目的基因，接著利用Qiagen純化柱回收純化DNA。具體：用3倍體積的特殊高鹽溶液于55°融化帶有目的基因的DNA片段的瓊脂糖凝膠塊，將DNA釋放到水溶液中。然后將其通過Qiagen純化柱，經(jīng)過如圖結(jié)合—洗滌—洗脫步驟，直接得到純化的DNA樣品。利用核酸探針雜交法鑒定目的基因第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日八、目的基因與表達(dá)載體的組合與導(dǎo)入表達(dá)載體：PBV220,，將PBV220和目的基因用雙酶切法處理，退火后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用CaCl2法導(dǎo)入到宿主大腸桿菌中，構(gòu)建工程菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用干擾素性質(zhì)鑒定目的工程菌，分離工程菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，提取出質(zhì)粒，分析質(zhì)粒穩(wěn)定性。第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日干擾素的發(fā)酵工藝過程啟開種子制備種子液發(fā)酵培養(yǎng)粗提精提半成品制備半成品檢定分裝凍干成品檢定成品包裝第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日1．菌種制備取－70℃下保存的甘油管菌種（工作種子批），于室溫下融化。然后，接入搖瓶，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)18±2小時后，進(jìn)行吸光值測定和發(fā)酵液雜菌檢查。2．種子罐培養(yǎng)將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0，級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)3～4小時，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，同時取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微鏡檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌

第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日3.發(fā)酵罐培養(yǎng)將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30℃，pH7.0。級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4小時。然后控制培養(yǎng)溫度20℃，pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)5～6.5小時。同時進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.0±1.0后，用5℃冷卻水快速降溫至15℃以下，以減緩細(xì)胞衰老?；蛘邔l(fā)酵液轉(zhuǎn)入收集罐中，加入冰塊使溫度迅速降至10℃以下。4.菌體收集將已降溫的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項目的檢測。菌體于－20℃冰柜中保存時，不得超過12個月。每保存3個月，檢查一次活性。第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日干擾素發(fā)酵過程控制在假單孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5小時分裂速度最快，到3.5小時開始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5小時之后，在4小時達(dá)到最大，然后由于降解而迅速下降?？梢娫诎l(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單孢桿菌的生長和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)，可采用兩段培養(yǎng)的策略進(jìn)行過程控制。第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日(1)．溶解氧控制分別在生長階段和生產(chǎn)階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發(fā)酵水平。通過級聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速得以實(shí)現(xiàn)。(2).溫度控制假單孢桿菌生長最適溫度與產(chǎn)物形成最適溫度是不同的。產(chǎn)物合成溫度控制在20℃可以有效防止干擾素-α2b的降解，而其最佳生長溫度則為30℃。質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速下降，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解，增加質(zhì)粒的穩(wěn)定性。(3)．pH值發(fā)酵過程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。干擾素-α的等電點(diǎn)在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受