課件教程說明

SampleSample&Assay2011年11miRNeasy2011年11Chineseprotocol血液中純化 從人類血液中提取總RNA和本操作流程需要額外訂購BufferELcatnoD2、冰上孵育10-15min。在孵育的過程中，短暫渦旋混勻2 孵育時間可以延長至20min。D3、4°C下400xg離心10min后續(xù) 例如，在D1步驟中加入的是1mL的血液，則加入2mL的BufferELD5、4°C下400xg離心10min注意：去除上清不完全將會影響之后的裂解釋放RNA的步驟，以及之后柱子對D6handbook第19頁中的操作步驟（ProtocolPurificationofTotalIncludingSmallRNAs,fromAnimalCells）的第二步。請見下一頁PPT

Protocol:PurificationofTotalRNA,IncludingSmall fromAnimal 2、在細胞懸浮液中加入QIAzolLysisReagent注意：細胞不完全懸浮會導致細胞裂解不充分并降低RNA產(chǎn)量3、處理的細胞在3x106以下，則渦旋震蕩1min注意：不完全勻質(zhì)化會導致RNA產(chǎn)量顯著減少，并會導致RNeasyMinispin柱子堵塞；勻質(zhì)化的細胞裂解液可以在–70°C這步有助于提于裂 白復合體5、在裝有勻漿的管子中加入140μl氯仿，并蓋好蓋子。用力震蕩15s；6、室溫下靜置2-3 7、4°C下12,000xg離心15min離心機恢復至室溫(15–25°C)離心后，樣本將分為三層：上清為無色，是含有RNA的水相； 色有機相。水相上清的體積約為350μl 段，請在這一步之后參照32頁的附錄A操作9、吸取700μl樣本液，包括之前可能產(chǎn)生的沉淀物，加在RNeasyMinispincolumn柱子上（柱子放在一個試劑盒提供的2ml收集管上）。輕輕蓋上蓋子，在大于8000xg10,000rpm)下室溫(15–25°C離心15s。棄掉收集管內(nèi)的液體?？稍诘?可選步驟：如果需要進行柱上DNase消化步驟，參照第36頁B1-B2B1350μlBufferRWTRNeasyMinispincolumn上，8000xgrpm)下離心15s 柱子。棄掉收集管內(nèi)的液體?？稍贐4重復利用該收集管B2、加10μlDNaseIstocksolution在70μl的BufferRDD里。溫和翻轉(zhuǎn)離心管混勻液體。不要渦旋震蕩。BufferRDD在RNase-FreeDNaseSet里有提供。B3、吸取配置好的DNaseI混合液（80μl）直接加在RNeasyMinispincolumn的膜上，在臺上靜置15min（20–30°C）。注意：必須確保將配置好的DNaseI混合液（80μl）全部直接加在RNeasyMinispincolumn的膜上，如果一部分混合液站在管壁上或者柱子的管口，將會導致DNase消化不完全。B4、吸取350μlBufferRWT加在RNeasyMinispincolumn上，8000xg(10,000rpm)下離心15s柱子。棄掉收集管內(nèi)的液體，收集管可重復利用。繼續(xù)第12 11、可選：吸取700μlBufferRWT加在RNeasyMinispincolumn上。輕輕蓋上蓋子，8000xg(10,000rpm)下離心15s 如果做了DNase12、吸取500μlBufferRPE加在RNeasyMinispincolumn上。輕輕蓋上蓋子，8000xg(10,000rpm)下離心15s 13、再一次吸取500μlBufferRPE加在RNeasyMinispincolumn子，8000xg10,000rpm)下離心2min干燥RNeasyMinispincolumn這一步是為了確保沒有乙醇轉(zhuǎn)入RNAelution步驟，殘留的乙醇會影響后續(xù)的注意：離心過后，取出RNeasyMinispincolumn 14、可選：將RNeasyMinispincolumn轉(zhuǎn)于新的2ml收集管中（未提供）舊的收集管和管內(nèi)液體。小型離心機內(nèi)全速離心1min這一步是為了消除可能存在于樣本中的BufferRPE，或者在13步中殘留于柱外15、將RNeasyMinispincolumn轉(zhuǎn)于新的1.5ml的收集管中（已提供）。吸取30–50μlRNase-freewater直接加在柱上。輕輕蓋上蓋子，8000xg(10,000rpm)下離心1min洗提RNA