PCR技術原理及實驗操作-2012年

PCR理論基礎及基本操作李靜2012.2.21第一節(jié)PCR技術聚合酶鏈式反應PolymeraseChainReaction

PCR的基本原理PCR的成分PCR的操作步驟一、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復制堿基互補配對原則A=T，G=C一級結(jié)構(gòu)的文字式縮寫基因TGCAGGTTAAAGG它的互補鏈:ACGTCCAATTTCC(誤)CCTTTAACCTGCA(正)3’-ACGTCCAATTTCC-5’(正)A—TG—CAAA-TA-TA—TC—GC—GG—CG—CA—TTTA—TG—CC—GA-TA-TA—TC—GG—CG—CA-TA—TG—CT—AC—GT—AA-TA-TA—TC—GG—CG-C二、PCR的成分

模板（TemplateDNA）引物（Primer）

TaqDNA聚合酶

dNTP

Taq聚合酶緩沖液（TaqBuffer）

所有成分在同一離心管中模板是一段單鏈或者雙鏈DNA，提供用于進行PCR擴增的原始信息對模板的純度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白等模板濃度過高會導致非特異性擴增增加模板DNA應該盡量保持低溫保存引物一段短的單鏈DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點，DNA聚合酶可由其3′端開始合成新的核酸鏈引物濃度過高易導致模板與引物錯配，反應特異性下降

；濃度過低產(chǎn)物量少TaqDNA聚合酶

以DNA為復制模板，從將DNA由5'端點開始復制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。必須一直保存于－20℃，內(nèi)含甘油保存最適反應溫度72℃，即延伸溫度在配制PCR體系的最后加入酶量增加使反應特異性下降；酶量過少影響反應產(chǎn)量dNTP脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，即合成新的DNA鏈的材料4種dNTP

的濃度相等濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應產(chǎn)量Buffer

維持Taq酶擴增的最適條件和穩(wěn)定性Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑過高:非特異擴增增加

過低:使Taq酶活性喪失，反應產(chǎn)物減少注意事項所有的PCR體系都應該在-20℃保存除了ddH2O之外，完全融化之后再加入，以免影響濃度配制反應體系應在冰上操作或快速進行，以減少非特異性擴增體系配制完成之后應馬上進行PCR反應分裝處理，專人專用，防止交互污染三、PCR的步驟三個步驟

變性(denaturation)-高溫下將模板DNA雙鏈打開

退火(annealing)-引物在較低溫度下以共價鍵結(jié)合到模板DNA互補部位

延伸(extension)-Taq酶作用下，不斷向引物3’端添加DNTP，DNA鏈不斷延伸反應液中含有所有成分，以溫度變化來控制反應階段：變性94度，退火58度，延伸72度。1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃變性第一輪擴增PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點58℃引物1引物2DNA引物退火PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃TaqTaqTaqTaq72℃PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR的特點PCR反應條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測的靈敏度可達3個RFU細菌檢測的最小檢出率為3個細菌簡便、快速一次性加好反應液，2～4小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNAPCR的反應體系標準的PCR反應體系

10X擴增緩沖液：5μl模板DNA:0.1~2μg

引物：各0.2~1μmol/L4種dNTP:各200μmol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5UddH2O補齊

總體積：50μl可以按照比例放大或者縮小體系，不同的PCR反應需要優(yōu)化按照實驗方案進行即可PCR實驗的設計除實驗樣品外，每個PCR反應都必須有陽性和陰性對照-針對模板陽性：驗證PCR反應體系和條件的正確性陰性：驗證PCR反應有無污染PCR循環(huán)參數(shù)94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循環(huán)30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保溫（熱力學參數(shù)）1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循環(huán)30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保溫

94℃預變性，3min

使DNA雙鏈完全打開退火：58℃，1min

溫度由引物長度和GC含量決定。

增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應的靈敏性。變性：94℃變性，45s

使雙鏈DNA解鏈為單鏈延伸：72℃，1min

溫度為Taq酶最適反應溫度72℃

時間由擴增片段的長度決定1min擴增1KB

循環(huán)次數(shù)：

主要取決于模板DNA的濃度

次數(shù)過多：擴增效率降低

錯誤摻入率增加第二節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

電泳的用途分離鑒定純度測定分子量凝膠電泳的種類瓊脂糖凝膠電泳()

聚丙烯酰胺凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點應用范圍（一）分離核酸原理

電荷效應

分子篩效應

分子構(gòu)象1.電荷效應核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負電荷，向正極移動在電泳緩沖液中，DNA帶負電荷，在電場作用下向正極移動電泳不能使用蒸餾水，必須使用電泳緩沖液2.分子篩效應小分子移動快，大分子移動慢3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開環(huán)DNA

+-（二）操作要點支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標準電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色1.支持物-瓊脂糖瓊脂糖是由1，3連接的B-D-半乳呋喃糖和1，4連接的3，6脫水α-L-半乳呋喃糖相間聯(lián)結(jié)而成。瓊脂中除瓊脂糖外，尚含有瓊脂糖果膠(Agaropectin)和丙酮酸等帶電荷基團分子，在瓊脂糖制備過程中盡可能地去除掉這些帶電荷分子，以便獲得品質(zhì)優(yōu)良的電荷中性產(chǎn)品。商品化的瓊脂糖西班牙瓊脂糖agrose與細菌培養(yǎng)用瓊脂agar的區(qū)別2.凝膠濃度的選擇凝膠的制備注意：使用電泳緩沖液進行配制；加熱過程中要不時搖動，使附著于壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液溶解。3.DNAmarker上樣3μl，750bp條帶為50ng，其它25ng上樣3μl，500bp條帶為50ng，其它25ngDNA長度標準曲線4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0凝膠制備時一定要使用電泳緩沖液

5.樣品制備DNA樣品每條帶>100ng上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍/二甲苯青作用：上色；沉降

點樣6.電泳條件恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm

高壓：>幾十V/cm溫度：15~25℃

7.電泳染色溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)熒光基團，在紫外光下顯色紫外燈下顯色Pipetman移液器（槍）的使用法國Gilson德國Eppendorf芬蘭Dragon工欲善其事必先利其器根據(jù)實驗需要選擇合適量程的移液器在該過程中，千萬不要將按鈕旋出量程，否則會卡內(nèi)部機械裝置而損壞了移液槍?？ňo的標志是略為超過O型環(huán)，并可以看到連接部分形成清晰的密封圈用大拇指將按鈕按下至第一檔，然后慢慢松開按鈕回原點。接著將按鈕按至第一檔排出液體，稍停片刻繼續(xù)按按鈕至第二檔吹出殘余的液體。最后先將移液器從液體中取出，后松開