液相色譜-脈沖安培依替米星檢測(cè)

液相色譜（反相)-脈沖安培檢測(cè)對(duì)硫酸依替米星的分析

一.摘要二.引言及基本介紹三.實(shí)驗(yàn)四.結(jié)果與討論五.結(jié)論一.摘要一種對(duì)于依替米星純度和含量的檢測(cè)的方法是通過(guò)液相色譜-脈沖安培檢測(cè)。流動(dòng)相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通過(guò)稀NaOH溶液調(diào)節(jié)成pH3.4的乙腈溶液所組成?？偡治鰰r(shí)間不超過(guò)30分鐘。本實(shí)驗(yàn)對(duì)于分離時(shí)不同的色譜參數(shù)也進(jìn)行了調(diào)節(jié)，并運(yùn)用這種方法對(duì)大量的硫酸依替米星的商業(yè)樣品進(jìn)行了分析。二.引言和基本介紹1.依替米星簡(jiǎn)介2.氨基糖苷類的檢測(cè)方法3.脈沖安培檢測(cè)（PAD）簡(jiǎn)介1.依替米星簡(jiǎn)介依替米星，是一個(gè)通過(guò)化學(xué)修飾慶大霉素的C1a而獲得的新的半合成的水溶性的氨基糖苷類抗生素，對(duì)氨基糖苷類和類似的奈替米星耐藥的革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有活性。依替米星的耳毒性和腎毒性大體上比其他的氨基糖苷類低，比其他的奈替米星類更低（耳毒性為奈替米星的1/2，丁胺卡納的1/7；腎毒性為奈替米星的1/12，丁胺卡納的1/17）。然而，依替米星的治療范圍窄并且要小心得檢測(cè)在血液中的水平。1.依替米星簡(jiǎn)介依替米星是慶大霉素的C1a的1-N-乙基衍生物。因此，慶大霉素C1a是可能的一種雜質(zhì)。還有慶大霉素C1a的衍生物3”-N-乙基（ETM-1)和1,3”-N-乙基”(ETM-2)，和一些中間體如3,2,6-N-乙?；?慶大霉素)和1-N-乙基-3,2,6-N-乙?；?慶大霉素(P2)有微弱的抗菌活性。這幾種物質(zhì)就是下面的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)的主要物質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如下：1.依替米星簡(jiǎn)介2.氨基糖苷類的檢測(cè)方法在過(guò)去的幾年中出現(xiàn)了大量的檢測(cè)氨基糖苷類抗生素的方法，包括微生物檢測(cè)，免疫測(cè)定，毛細(xì)管電泳，薄層色譜法，氣液色譜，利用紫外檢測(cè)的柱前衍生化的高壓液相色譜，電化學(xué)，質(zhì)譜法。依替米星有氨基糖苷類的結(jié)構(gòu)，以上提到的方法也應(yīng)當(dāng)可以運(yùn)用。（有興趣的話自己下去學(xué)）由于柱前衍生化是不方便的，耗時(shí)的并且定量的時(shí)候有一些問(wèn)題或者導(dǎo)致不穩(wěn)定的衍生，電化學(xué)檢測(cè)尤其是脈沖安培檢測(cè)是更好的。3.脈沖安培檢測(cè)簡(jiǎn)介安培檢測(cè)器由恒電位器和三電極電化學(xué)池組成。三電極就是工作電極、參比電極和對(duì)電極，在工作電極和參比電極之間施加的是發(fā)生氧化反應(yīng)或者還原反應(yīng)所需的電位，稱為施加電位或者工作電位。在工作電位上施加階躍電位的稱為脈沖安培法。脈沖安培檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)中需要使用三階電位，Εdet,Εoxd和Εred，因此必須設(shè)定各脈沖的幅度和間隔時(shí)間。3.脈沖安培檢測(cè)3.脈沖安培檢測(cè)簡(jiǎn)介可用于安培檢測(cè)的物質(zhì)需具有電化學(xué)活性，并較易發(fā)生電化學(xué)氧化還原反應(yīng)。電化學(xué)檢測(cè)靈敏度高，具有很好的選擇性。特別是對(duì)于那些不具有紫外-可見(jiàn)或熒光生色團(tuán)的物質(zhì)的檢測(cè)，脈沖安培檢測(cè)是一個(gè)很好的補(bǔ)充手段。3.脈沖安培檢測(cè)簡(jiǎn)介通常，溶液的pH值對(duì)電化學(xué)反應(yīng)的影響很大，如果反應(yīng)過(guò)程中有H+或者OH-的參與，其氧化還原電位和檢測(cè)靈敏度將隨pH值的不同而變化。當(dāng)流動(dòng)的酸堿度不能達(dá)到檢測(cè)所需的最佳pH時(shí)，可在分離柱和檢測(cè)器之間通過(guò)柱后加入適當(dāng)?shù)娜芤哼M(jìn)行調(diào)節(jié)，以保證檢測(cè)的靈敏度。3.脈沖安培檢測(cè)檢測(cè)液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)不能取代常規(guī)的紫外-可見(jiàn)檢測(cè)，但卻是一個(gè)重要的補(bǔ)充手段，特別是那些不具有生色基團(tuán)，不能用紫外-可見(jiàn)吸收有效檢測(cè)的物質(zhì)尤為需要。三、實(shí)驗(yàn)在這里主要講實(shí)驗(yàn)中的色譜方法。流動(dòng)相是由0.033mol/L草酸，0.012mol/L七氟丁酸，和通過(guò)稀NaOH溶液調(diào)節(jié)成pH3.4的乙腈溶液所組成。使用之前要用0.45微米的過(guò)濾器和超生進(jìn)行過(guò)濾，流速是每分鐘一毫升。所有被分析的物質(zhì)都要溶解到流動(dòng)相中。為了進(jìn)行脈沖安培檢測(cè)，0.52mol/L的氫氧化鈉通過(guò)一個(gè)混合型三通從氮?dú)饧訅核畮?kù)加入到柱后并且混合到填充反應(yīng)管。加入的酸的流速是不重要的，但他在流動(dòng)過(guò)程中應(yīng)該是重復(fù)的并且是沒(méi)有脈沖的。將流動(dòng)相的pH提高到大約13來(lái)增加檢測(cè)的靈敏度是必要的。三、實(shí)驗(yàn)對(duì)于脈沖安培檢測(cè)時(shí)間和電壓參數(shù)設(shè)置如下：E1為0.12V;E2為0.70V；E3為-0.60V。t1為0-0.4秒；t2為0.41-0.60秒；t3為0.61-1秒。信號(hào)的整合是在0.2-0.4秒。四、結(jié)果和討論1.色譜條件的選擇2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性3.液相色譜的定量方面4.商業(yè)樣品的分析1.色譜條件的選擇分離依替米星和它的相關(guān)物質(zhì)的不同色譜參數(shù)的影響用保留時(shí)間和分辨率進(jìn)行評(píng)估。保留時(shí)間指被分離樣品組分從進(jìn)樣開(kāi)始到柱后出現(xiàn)該組分濃度極大值時(shí)的時(shí)間，也即從進(jìn)樣開(kāi)始到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為此組分的保留時(shí)間，用RT表示，常以分（min）為時(shí)間單位。保留時(shí)間是由色譜過(guò)程中的熱力學(xué)因素所決定，在一定的色譜操作條件下，任何一種物質(zhì)都有一確定的保留時(shí)間，有著類似于比移值相同的作用，可作為色譜定性分析的依據(jù)。1.色譜條件的選擇在流動(dòng)相中增加乙腈的數(shù)量和乙腈濃度的些許不同而使得保留時(shí)間減少有著顯著的影響。為檢查草酸量的影響，草酸在流動(dòng)相中的濃度是按照下面的濃度進(jìn)行變化的：0.025,0.028,0.033和0.036mol/L。在檢查的范圍內(nèi)，草酸的量對(duì)保留時(shí)間沒(méi)有顯著的影響。用pH2.5—4.5的緩沖液來(lái)檢測(cè)流動(dòng)相pH的影響。pH在3-4幾乎沒(méi)有影響。隨著進(jìn)一步降低或者增加pH，保留時(shí)間就減少。（見(jiàn)下圖）1.色譜條件的選擇1.色譜條件的選擇七氟丁酸的濃度在0.0074-0.015mol/L時(shí)對(duì)保留時(shí)間沒(méi)有影響，隨著七氟丁酸的增加，保留時(shí)間增加了很多。在柱溫的影響方面檢測(cè)了35,40和45度。正如預(yù)期的那樣，當(dāng)柱溫增加的時(shí)候保留時(shí)間就減少了（和粘度有關(guān)，由于溫度升高，粘度減小，所以保留時(shí)間減少）。2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性電流-電壓的伏安響應(yīng)曲線被用來(lái)篩選電壓的檢測(cè)操作條件。這些展示在下圖中。（虛線是參比溶液，實(shí)線是依替米星樣品）測(cè)依替米星時(shí)在金電極表面的氧化出現(xiàn)在0-0.4V。參比溶液在這個(gè)區(qū)域幾乎沒(méi)有陽(yáng)離子電流。參比溶液的電化學(xué)響應(yīng)是由于在E大于0.4V時(shí)表面氧化物的形成和E大于0.7V時(shí)氧氣析出。循環(huán)的伏安數(shù)據(jù)表明依替米星的脈沖安培檢測(cè)-液相色譜時(shí)工作電位應(yīng)當(dāng)設(shè)置到0-0.4伏。2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性下圖顯示了背景的一個(gè)情節(jié)，依替米星的響應(yīng)對(duì)應(yīng)著測(cè)量工作電壓。背景反應(yīng)和依替米星反應(yīng)的最大差出現(xiàn)在大約0.12V。這是工作電壓在最后方法條件時(shí)的電壓。檢測(cè)時(shí)E1=0.12V的信號(hào)-噪聲比是3250，這比其他檢測(cè)電壓時(shí)的比值更大。2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性2.波形優(yōu)化和電極穩(wěn)定性雖然理論上的電位序列清洗了電極表面，為獲得好的重復(fù)性金的工作電極在分析60次后是有必要進(jìn)行磨光的。在電極用精細(xì)拋光化合物清洗后，應(yīng)當(dāng)在水中超生10分鐘。在同一時(shí)間用紙巾清除計(jì)數(shù)電極和參考電極的沉積物質(zhì)是合適的。3.液相色譜的定量方面依替米星和相關(guān)物質(zhì)的線性是在0.005-0.125mg/mL的濃度范圍內(nèi)檢測(cè)出來(lái)的。結(jié)果在表1中。其中y是峰面積，x是注入標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mg/mL），r是相關(guān)系數(shù)。可重復(fù)性是分析0.05mg/mL的每一個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液六次，峰面積的RSD在表1中。3.液相色譜的定量方面4.商業(yè)樣品的分析三個(gè)商業(yè)的硫酸依替米星，從三個(gè)不同的產(chǎn)商獲得，用所描述的方法進(jìn)行了分析。將得到的樣品的組分展示在表2中。所有較小的成分都用依替米星的相對(duì)數(shù)量來(lái)表示，用檢測(cè)商業(yè)樣品的百分之5的稀釋液獲得色譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ET2是主要的雜質(zhì)，沒(méi)有用其他的方法進(jìn)行檢測(cè)。可以看出，依替米星樣品的組成是依賴于原始的樣品的。同