登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)云南省寄生蟲病防治所2014年10月概要檢測(cè)目的檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)復(fù)核檢測(cè)檢測(cè)方法樣本采集、保存和運(yùn)輸檢測(cè)目的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷病例。病毒分型和溯源。為登革熱流行趨勢(shì)的預(yù)測(cè)、預(yù)警和制定防治對(duì)策、措施提供科學(xué)依據(jù)。檢測(cè)對(duì)象疑似和臨床診斷病例（按照登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)WS216-2008）。檢測(cè)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)登革熱疑似病例發(fā)生所在地醫(yī)院和/或縣（市）疾控機(jī)構(gòu)采集病例血清，檢測(cè)登革病毒抗原、核酸或抗體。登革熱疑似病例實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程檢測(cè)內(nèi)容復(fù)核檢測(cè)送州/市CDC或云南省寄生蟲病防治所的臨床標(biāo)本，抽樣30%進(jìn)行復(fù)核檢測(cè)，疫點(diǎn)首發(fā)病例需采用病原學(xué)和/或雙份標(biāo)本血清學(xué)方法復(fù)核檢測(cè)，暴發(fā)疫情復(fù)核檢測(cè)不少于5例，疫情少于5例者應(yīng)全部檢測(cè)，病毒核酸陽(yáng)性標(biāo)本應(yīng)分型檢測(cè)。疫點(diǎn)首發(fā)病例，重癥病例、輸入病例急性期標(biāo)本應(yīng)采用PCR方法進(jìn)行分型檢測(cè)，陽(yáng)性者分離病毒，從臨床標(biāo)本或所分離病毒中擴(kuò)增E蛋白編碼基因，完成序列分析。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)陰性臨床病例以及重癥病例，應(yīng)對(duì)恢復(fù)期血清進(jìn)行IgM、IgG抗體和/或中和抗體檢測(cè)。檢測(cè)方法病原學(xué)檢測(cè)主要適用于急性期血液標(biāo)本。1、抗原檢測(cè)：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標(biāo)本NS1抗原檢出率高。標(biāo)本中檢出NS1抗原可以確診病毒感染，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可用于早期診斷2、核酸檢測(cè)：一般發(fā)病后6天內(nèi)血液標(biāo)本病毒核酸檢出率高。在病人血清中檢出病毒核酸，可確診而且能夠分型，可用于早期診斷，但核酸檢測(cè)容易因污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此要求嚴(yán)格分區(qū)操作3、病毒分離：一般發(fā)病后5天內(nèi)血液標(biāo)本病毒分離率較高。將標(biāo)本接種于蚊源細(xì)胞（C6/36）或哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK21、Vero）進(jìn)行分離培養(yǎng)，出現(xiàn)病變以后，用檢測(cè)抗原或核酸的方法鑒定病毒。分離到登革病毒可以確診，但其耗時(shí)長(zhǎng)，不適于快速診斷。檢測(cè)方法血清學(xué)檢測(cè)主要適用于發(fā)病5天以后血液樣本，但需注意可能與其他黃病毒感染發(fā)生交叉反應(yīng)。1、血清特異性IgM抗體：采用ELISA、免疫層析等方法檢測(cè)。IgM抗體陽(yáng)性，提示患者可能新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷，但單份標(biāo)本不能確診2、血清特異性IgG抗體：采用ELISA、免疫熒光（IFA）、免疫層析等方法檢測(cè)?；颊呋謴?fù)期血清IgG

抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診3、中和抗體：采用空斑減少中和實(shí)驗(yàn)、微量中和實(shí)驗(yàn)等方法檢測(cè)，可用于分型?；颊呋謴?fù)期血清中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)或滴度較急性期呈4倍及以上升高可以確診。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原

檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒抗原檢測(cè)試劑盒（酶聯(lián)免疫法）酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原操作步驟1、將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30分鐘，使用前將試劑輕輕震蕩混勻。2、配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。3、編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔板編號(hào)，每板設(shè)陰性對(duì)照3孔，陽(yáng)性對(duì)照2孔和空白對(duì)照1孔。4、加稀釋液：每孔加稀釋液50μL，空白孔除外。5、加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測(cè)樣品或陰陽(yáng)性對(duì)照各50μL，空白孔除外。6、溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育60分鐘。7、每孔加酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外，輕輕震蕩混勻。8、溫育：用封板膜封板后，置37℃溫育30分鐘。9、洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后一次盡量扣干。10、顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。11、測(cè)定：每孔加終止液50μL，10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)于450nm處（建議使用雙波長(zhǎng)450nm/600-650nm檢測(cè)），用空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔A值。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒NS1抗原結(jié)果判定1、臨界值計(jì)算：臨界值=0.10+陰性對(duì)照孔A值均值（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者以0.05計(jì)算）。2、陰性對(duì)照的正常值范圍：陰性對(duì)照孔A≤0.1（若1孔A大于0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對(duì)照大于0.1，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)）。3、陽(yáng)性對(duì)照正常值范圍：A≥0.8.4、陽(yáng)性判定：樣品A值≥臨界值者為登革病毒抗原陽(yáng)性。5、陰性判定：樣品A值＜臨界值者為登革病毒抗原陰性。意義結(jié)合臨床信息，陽(yáng)性結(jié)果可以診斷為登革病毒感染，但陰性結(jié)果并不排除登革病毒感染的可能。膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原

檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、登革熱病毒抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）檢測(cè)步驟1、將試劑盒和待檢樣本自冰箱中取出平衡至室溫。2、當(dāng)準(zhǔn)備好測(cè)試時(shí)，打開密封的鋁箔袋，取出檢測(cè)卡，平放于水平桌面上。3、在檢測(cè)卡上標(biāo)記病人的樣本號(hào)。4、加樣：用滴管從樣本中取1滴（約30-45μL）血清或血漿標(biāo)本，加于檢測(cè)卡/條上的加樣區(qū)內(nèi)，另外加1滴（約30-45μL）稀釋液，保證操作過(guò)程中沒有氣泡產(chǎn)生。（如果加樣后30秒鐘，沒有看到樣本移動(dòng)，可能是由于樣本太黏稠，可在樣本加樣孔內(nèi)再加1滴樣本稀釋液。5、加入樣本后20-25分鐘內(nèi)判讀結(jié)果，并將結(jié)果拍照。膠體金免疫層析法檢測(cè)登革病毒NS1抗原

結(jié)果判定1、陰性結(jié)果：僅質(zhì)控線C出現(xiàn)肉眼可見條帶。2、陽(yáng)性結(jié)果：質(zhì)控線C和檢測(cè)線T均出現(xiàn)肉眼可見條帶。3、無(wú)效結(jié)果：未肉眼可見的質(zhì)控線C4、質(zhì)量控制：如遇下列情況，請(qǐng)按上述操作步驟使用實(shí)驗(yàn)室備用的陽(yáng)性和陰性樣本對(duì)該批產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制：4.1、新檢驗(yàn)員使用本產(chǎn)品。4.2、使用新批號(hào)產(chǎn)品。4.3、試劑卡儲(chǔ)存溫度在2-30℃以外。4.4、測(cè)試區(qū)溫度在2-30℃以外。9意義陽(yáng)性結(jié)果說(shuō)明檢測(cè)到登革病毒抗原，結(jié)合臨床可以診斷為登革病毒感染；陰性結(jié)果說(shuō)明沒有檢測(cè)到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用NS1快速診斷卡的使用IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：1、抗原：陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。2、抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；3、登革病毒IgM陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；4、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；5、緩沖液：洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；稀釋液：pH7.4PBS（5％牛血清）；封閉液：pH9.6碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；6、顯色液：A/B液7、終止液：4NH2SO4IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體檢測(cè)步驟1、

用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過(guò)夜；2、棄去抗人μ鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時(shí)；3、棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。4、將待檢血清用稀釋液從1：10開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板孔中，100μl/孔，同時(shí)加入已1：10稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時(shí)；5、棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個(gè)型DV抗原及陰性抗原對(duì)照，100μl/孔，4℃過(guò)夜；6、棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正常抗原加4個(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，100μl/孔，37℃水浴2小時(shí)；7、棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；8、加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體結(jié)果判斷1、目測(cè)方法：陽(yáng)性對(duì)照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對(duì)照孔呈無(wú)色，對(duì)照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（TMB），則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。2、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)：于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N≥2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值≥2.1，則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體檢測(cè)儀器設(shè)備和材料加樣器、溫箱、洗板機(jī)、含波長(zhǎng)450nm的酶標(biāo)儀、登革病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒，或?qū)嶒?yàn)室自備材料：1、抗原：陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照。2、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；3、緩沖液：包被液：pH9.6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；4、顯色液：A/B液5、終止液：4NH2SO46、酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體檢測(cè)步驟1、

用包被液按工作濃度稀釋抗原，100μl/孔，4℃過(guò)夜；2、棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌3～5次，甩干；3、將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100μl/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，37℃水浴1小時(shí)；4、棄去血清，用洗滌液洗滌5～6次；5、加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100μl/孔，37℃水浴1小時(shí)；6、棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；7、加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；8、加終止液于每反應(yīng)孔，100μl/孔。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)登革病毒IgG抗體結(jié)果判斷于450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N≥2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值≥2.1，則標(biāo)本為登革熱IgG抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）意義陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到DV感染；恢復(fù)期血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，或抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍及以上升高則可確診。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體檢測(cè)儀器設(shè)備和材料1、

DV1～4型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染VERO或BHK21細(xì)胞制備，低溫干燥保存；2、對(duì)照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽(yáng)性對(duì)照），非登革熱患者血清陰性對(duì)照)；3、羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標(biāo)記抗體；4、常用稀釋液：pH7.2～7.4PBS、伊文思蘭等；5、熒光顯微鏡。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體檢驗(yàn)步驟：1、用pH7.4，0.02mol/LPBS稀釋待檢血清，從1:20開始做2倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度。2、取出抗原片，用蒸餾水漂洗后，風(fēng)干。3、用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個(gè)加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在37℃水浴箱濕盒孵育30分鐘（每次試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陽(yáng)、陰性對(duì)照）。4、用PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗滌1次脫鹽，風(fēng)干。5、用含1：3萬(wàn)的伊文思蘭PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)），在37℃水浴箱濕盒孵育30分鐘，然后同（4）洗滌、漂洗、吹干。6、熒光顯微鏡觀察結(jié)果。免疫熒光法檢測(cè)登革病毒IgG抗體結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在