第8講-成體干細(xì)胞及組織工程學(xué)

成體干細(xì)胞及組織工程學(xué)臨床血液教研室1什么是成體干細(xì)胞？

（somaticstemcelloradultstemcells）指存在于分化組織中的未分化細(xì)胞，具有自我更新、構(gòu)建和補(bǔ)充相應(yīng)組織中各種類型細(xì)胞的潛能。成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中。2主要的成體干細(xì)胞：造血干細(xì)胞（hematopoieticstemcell,HSC）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcell,MSC）神經(jīng)干細(xì)胞（neuralstemcell,NSC）表皮干細(xì)胞（epidexmisstemcell,ESC）臍血干細(xì)胞（cordbloodstemcell）腫瘤干細(xì)胞（cancerstemcell）3CSCsandstemcellniche在腫瘤細(xì)胞中存在著小部分的腫瘤干細(xì)胞（cancerstemcells,CSCs），是腫瘤形成、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的決定性原因和基礎(chǔ)。4成體干細(xì)胞來源：可能是胚胎細(xì)胞殘留于機(jī)體，并在干細(xì)胞微環(huán)境的作用下保持靜息狀態(tài)。存留的組織需要修復(fù)，便在特定微環(huán)境下被激活并分化成所需的細(xì)胞。5成體干細(xì)胞三大特征：自我更新種系定向分化能力：具有多能分化特性，能夠分化為特定組織的多種細(xì)胞類型，但分化潛能有限。在特定組織定居：大多數(shù)成體干細(xì)胞處于休眠狀態(tài)（G0期），病理因素或誘導(dǎo)后表現(xiàn)再生和更新能力，替代受損細(xì)胞或死亡細(xì)胞。

6胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞具有自我更新和分化形成任何類型細(xì)胞的能力，有形成完整個(gè)體的分化潛能?？煞只蔀槿?00多種細(xì)胞類型，進(jìn)一步形成機(jī)體的所有組織、器官。胚胎干細(xì)胞——全能干細(xì)胞(totipotentstemcell)7多能干細(xì)胞能產(chǎn)生多種類型細(xì)胞的能力，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。單能干細(xì)胞只能向單一方向分化，產(chǎn)生一種類型的細(xì)胞。成體干細(xì)胞——多能干細(xì)胞(pluripotentstemcell)或單能干細(xì)胞(unipotentstemcell)8干細(xì)胞橫向分化（transdifferentiation）組織干細(xì)胞通過活化潛在的其他分化程序，改變了組織干細(xì)胞的特異性種系分化進(jìn)程，可分化成其它組織細(xì)胞的能力。造血干細(xì)胞向非造血組織細(xì)胞分化、神經(jīng)干細(xì)胞向血液系統(tǒng)細(xì)胞分化9造血干細(xì)胞（HSC）胚胎期——定位于胎肝（Fetalliver,FL）成年哺乳動(dòng)物——骨髓，外周血、臍帶血轉(zhuǎn)錄因子MLL（mixed-lineage-leukemiagene），RunX1，TEL/ETV6，SCL/Tal1，LMO2對胚胎期HSC分化發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用。

10HSC特性：HSC的更新與分化：采用不對稱的分裂方式：其中一個(gè)細(xì)胞仍然保持干細(xì)胞的一切生物特性，從而保持HSC數(shù)量相對穩(wěn)定，這就是干細(xì)胞自我更新。另一個(gè)則進(jìn)一步增殖分化為各類血細(xì)胞、前體細(xì)胞和成熟血細(xì)胞，釋放到外周血中，執(zhí)行各自任務(wù)，直至衰老死亡，這一過程是不停地進(jìn)行著的11多向分化潛能自我更新造血干細(xì)胞的分化：11造血干細(xì)胞微環(huán)境

血管周圍微環(huán)境、骨內(nèi)膜微環(huán)境：維持干細(xì)胞“干性”13造血干細(xì)胞的分離與鑒定人HSC表面標(biāo)志物：CD34+、Lin-、c-kit+、sca-1+，Thy-1,IL-7Ra,Flt3,CD150。流式細(xì)胞分選技術(shù)，免疫磁珠分選。HSC的功能鑒定：致死劑量放射線照射動(dòng)物，HSC移植可以重建骨髓的造血功能，長期（>16周）產(chǎn)生多系成熟血液細(xì)胞。

14骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)

主要從骨髓中分離，胎盤、脂肪組織、臍血和肝臟也存在MSC。人MSC標(biāo)志物：CD73+、CD90+、CD105+、CD45-小鼠MSC標(biāo)志物：Sca-1+、CD90+、CD45-

1516MSC在低血清培養(yǎng)基中具貼壁優(yōu)勢特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，可純化及擴(kuò)增MSC全骨髓法根據(jù)骨髓中各細(xì)胞成分比重的不同，分離單核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)密度梯度離心法MSC的主要分離手段流式或磁珠分選后的細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢，成本較高、技術(shù)難度較大，限制了這些方法的廣泛應(yīng)用流式細(xì)胞儀法、免疫磁珠法17向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞分化MSC的分化骨髓中的多向分化干細(xì)胞（骨、軟骨、脂肪、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞）；容易獲得；體外擴(kuò)增109倍仍不失多向分化潛能；外源基因容易插入；免疫原性較弱；常見的組織工程種子細(xì)胞18MSC的優(yōu)點(diǎn)肝干細(xì)胞的可能位置：位于Hering’s管區(qū)域內(nèi)，直接參與肝臟的生長和發(fā)育，同時(shí)也是肝細(xì)胞再生的重要細(xì)胞來源。HSC、臍帶血干細(xì)胞和MSC在一定培養(yǎng)條件下也可以向肝細(xì)胞分化。肝干細(xì)胞(hepaticstemcell)19角蛋白19(cytokeratin19,CK19)神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neuralcelladhesionmolecule，NCAM)上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)claudin-3(CLDN-3)人肝干細(xì)胞特征性標(biāo)志物20細(xì)胞因子：成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2)、人activinA、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、骨形成蛋白2(BMP2)化學(xué)誘導(dǎo)劑：DMSO、地塞米松(Dex)、丁酸鈉(NaB)、制瘤素(OSM)肝干細(xì)胞定向分化肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化因子21實(shí)例：2000年8月，日本筑波大學(xué)把鼠肝干細(xì)胞體外培養(yǎng)后，移植到肝功能衰竭的鼠肝中，40天后干細(xì)胞發(fā)育成新的肝組織，分泌出鼠肝特異清蛋白。肝干細(xì)胞定向分化221992年Reynolds和Weiss首先從成年小鼠的紋狀體和海馬中分離出NSC。1998年，Okano報(bào)道，成人腦室下區(qū)存在神經(jīng)干細(xì)胞。1999年，Johnasson證實(shí)，成年哺乳動(dòng)物腦室管壁的室管膜細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。1999年，Doetsch報(bào)道，成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)室下區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)NSC的可能位置23巢蛋白(nestin)：一個(gè)比較公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物。僅在胚胎早期神經(jīng)上皮表達(dá)，出生后停止表達(dá)。一旦神經(jīng)前體細(xì)胞分化即停止表達(dá)A2B5蛋白Vimentin膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物(GFAP)等細(xì)胞表面抗原：CD133+/CD34-/CD45-；NSC的表面標(biāo)志物24帕金森病(Parkinsondisease，PD)阿爾茲海默病(Alzheimerdisease，AD)亨廷頓病(Huntingtondisease，HD)25神經(jīng)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用首都醫(yī)科大學(xué)附屬神經(jīng)外二科主任黃紅云等自2001年起在世界上率先開展流產(chǎn)胎（嬰）兒嗅鞘細(xì)胞(一種NSC)移植治療脊髓損傷。已經(jīng)治療近400例，部分完全性脊髓損傷患者恢復(fù)部分功能。26表皮干細(xì)胞(Skinstemcell,SSC)---SSC的來源或部位：

表皮干細(xì)胞：基底細(xì)胞毛囊干細(xì)胞：毛囊膨脹部位的真皮乳頭細(xì)胞團(tuán)

27表皮干細(xì)胞---SSC特異生物標(biāo)記：K4、K14角蛋白---SSC干性的體內(nèi)維持：整聯(lián)蛋白、鈣黏連蛋白將SSC與基底膜細(xì)胞強(qiáng)烈黏附，維持SSC在干細(xì)胞巢中附著，并維持其增殖與干性---SSC的分化：Wnt信號(hào)激活SSC增殖分化28表皮干細(xì)胞終生都在更新；體外培養(yǎng)表皮干細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)非常成熟；治療的效果易于觀察，萬一發(fā)生不良反應(yīng)可方便地移去；表皮干細(xì)胞特點(diǎn)與優(yōu)勢291996，我國徐榮祥在燒傷創(chuàng)面上找到皮膚組織原位再生的原始細(xì)胞“角蛋白十九型皮膚干細(xì)胞”。并成功誘導(dǎo)其分化生成皮膚細(xì)胞，使受傷的皮膚得以迅速康復(fù)，實(shí)現(xiàn)人體器官原位再生，獲得美國專利。已經(jīng)成功應(yīng)用于遺傳性水皰病、大皰性表皮松懈癥的基因治療30組織工程（TissueEngineering）定義：應(yīng)用生命科學(xué)與工程學(xué)的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物的正常及病理狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)、功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護(hù)、促進(jìn)人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。31種子細(xì)胞支架材料和細(xì)胞外基質(zhì)細(xì)胞與材料的體外復(fù)合培養(yǎng)(細(xì)胞生長環(huán)境方式、應(yīng)力，材料改性等)體內(nèi)植入(材料生物相容度、降解與細(xì)胞功能的同步化、營養(yǎng)支持、血管生成等)檢測和管理臨床驗(yàn)證產(chǎn)業(yè)化組織工程研究內(nèi)容32種子細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞：存在倫理問題，來源不易。成體干細(xì)胞：易獲得，自身的成體干細(xì)胞沒有免疫原性。33體外途徑：從病人體內(nèi)獲取細(xì)胞，體外培養(yǎng)并導(dǎo)入目的基因后，重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)途徑：直接將基因或攜帶目的基因的經(jīng)改造的病毒導(dǎo)入人體患病組織中。34干細(xì)胞定向分化的基因策略選擇安全、無毒、容易穿過細(xì)胞膜的基因載體，將治療基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。理想載體的條件：易獲得高滴度的純品；能穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)染體內(nèi)非增殖狀態(tài)的細(xì)胞；可以長期、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因而不會(huì)引起細(xì)胞毒性、感染或免疫應(yīng)答；能特異地識(shí)別靶組織，在其中表達(dá)外源基因；35干細(xì)胞基因治療關(guān)鍵問題西班牙馬德里自治大學(xué)博爾納德教授和丹麥歐登塞大學(xué)醫(yī)院布瑞恩斯(CancerRes,2005):體外培育人體間充質(zhì)干細(xì)胞6-8周是安全的；超過4-5個(gè)月，這種干細(xì)胞會(huì)發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化；體外培養(yǎng)8個(gè)月、分裂了90-140代的人體間充質(zhì)干細(xì)胞移植至動(dòng)物體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)“最老的”細(xì)胞發(fā)生了癌變。36轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞安全性問題原因——端粒酶端粒酶有阻止端粒隨細(xì)胞分裂而逐漸縮短的作用，從而穩(wěn)定染色體的末端，在保持細(xì)胞“永生”性中起重要作用。干細(xì)胞的端粒酶基因活化，最終將其變成癌細(xì)胞。

37ECM——蛋白多糖、糖蛋白、膠原纖維ECM是細(xì)胞附著的基本框架和代謝場所，其形態(tài)和功能直接影響所構(gòu)成的組織形態(tài)和功能。理想的ECM應(yīng)具有以下特點(diǎn)①生物相容性好②有可吸收性③有可塑性④表面化學(xué)特性和表面微結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞的粘附和生長⑤降解速率可根據(jù)不同細(xì)胞的組織再生速率而進(jìn)行調(diào)整。38細(xì)胞外基質(zhì)的研究天然ECM：采用膠原制作人工皮膚和血管模型人工的ECM：聚乳酸、聚羥基乙酸、兩者的共聚物(PGA-PLA)、聚ρ-羥基丁酯(PHB)；聚乳酸-已內(nèi)酯的共聚物(PLC)、聚原酸酯、聚磷本酯、聚酸酐天然高分子與合成高分子的復(fù)合物，如膠原-PCA的復(fù)合物等有機(jī)材料與無機(jī)材料的復(fù)合物，如羥基磷灰石-甲殼素的復(fù)合物，羥基磷灰石-PLA的復(fù)合物等39細(xì)胞外基質(zhì)的研究——組織工程所應(yīng)用的材料制備干細(xì)胞，誘導(dǎo)定向分化；建立由細(xì)胞和可降解材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體；采用穩(wěn)定的培養(yǎng)系統(tǒng)，是工程組織維持長期的分化狀態(tài)。40組織工程(體外)實(shí)施的三大步驟組織相容性；材料降解與細(xì)胞功能發(fā)揮的同步化；代謝活動(dòng)，營養(yǎng)來源，血管化過程及方式；與生長發(fā)育的關(guān)系，細(xì)胞的作用及轉(zhuǎn)歸，植入體的最終結(jié)局；體內(nèi)生物力學(xué)，免疫學(xué)；對藥物治療的反應(yīng)。41體內(nèi)植入研究42骨組織構(gòu)建構(gòu)建組織工程骨的方式有幾種①支架材料與成骨細(xì)胞；②支架材料與生長因子；③支架材料與成骨細(xì)胞加生長因子。一名7歲男孩沈某因車禍造成顱骨6×6厘米缺損；采用組織工程技術(shù)構(gòu)建的顱骨移植修復(fù)，經(jīng)4個(gè)月隨訪，這塊占顱骨總面積達(dá)1/6的組織工程化顱骨在人體內(nèi)穩(wěn)定存在，生長良好。43人工皮膚“Apligraf”已經(jīng)在美國面市；Organogenesis公司研制的與人類皮膚相同的Apligraf，是第一個(gè)獲得美國食品及藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的人造組織。它最初用于治療腿部潰瘍，也可用于治療足部潰瘍和燒傷。44人工皮膚一種能夠使膝關(guān)節(jié)軟骨再生的產(chǎn)品已經(jīng)面市。已為一個(gè)男孩培養(yǎng)了一個(gè)胸廓，并在裸鼠身上制造出了人耳。45人工軟骨——人耳鼠2001.8.，德國杜塞尓多夫大學(xué)醫(yī)院施特勞尓教授等宣布：從心肌梗塞患者