番茄紅素的發(fā)酵生產(chǎn)

目錄番茄紅素簡(jiǎn)介研究背景三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)紅酵母生產(chǎn)番茄紅素總結(jié)與展望番茄紅素的發(fā)酵生產(chǎn)研究進(jìn)展植物黃金——番茄紅素2023/2/5

番茄紅素（Lycopene）是類胡蘿卜素的一種，是一種很強(qiáng)的抗氧化劑，在清除人體“萬病之源”――自由基方面，番茄紅素的作用比β-胡蘿卜素更強(qiáng)大。

2003年，美國(guó)《時(shí)代》雜志把番茄紅素列在“對(duì)人類健康貢獻(xiàn)最大的食品”之首，番茄紅素也因此被稱為“植物中的黃金”。2023/2/5番茄紅素的結(jié)構(gòu)

在自然界中番茄紅素主要以全反式結(jié)構(gòu)存在。而全反式結(jié)構(gòu)是一種具有11個(gè)碳碳共軛雙鍵的非環(huán)狀平面共軛多不飽和脂肪烴，因而它更易于被氧化。而抗氧化性是番茄紅素一切功效的源泉。2023/2/5研究背景：

1873年，Hartsen首次從番茄漿果中提取出來一種呈深紅色的晶體

1903年，Schunch將這種從番茄中提取到的物質(zhì)正式命名為番茄紅素。

過去人們一直認(rèn)為，只有那些具備β—紫羅酮環(huán)并能轉(zhuǎn)化為維生素A的類胡蘿卜素，如α—胡蘿卜素、β—胡蘿卜素等才與人類的營(yíng)養(yǎng)和健康有關(guān)，而番茄紅素因缺乏此結(jié)構(gòu)，不具有維生素A的生理活性，故對(duì)此研究很少；

但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素有比其他類胡蘿卜素更好的生物活性，并且是防病治病的重要功能因子，已成為目前國(guó)際上功能食品成分研究的一個(gè)熱點(diǎn)。2023/2/5研究背景：

對(duì)番茄紅素的研究在2000年以前鮮有報(bào)道，近幾年驟然升溫，2009-2014年，與番茄紅素有關(guān)的報(bào)道達(dá)1000多篇，內(nèi)容包括：番茄紅素的性質(zhì)和提取方法；番茄紅素及其研究進(jìn)展；番茄紅素的生產(chǎn)工藝研究進(jìn)展等。近10年，僅在中國(guó)申請(qǐng)的有關(guān)番茄紅素的國(guó)內(nèi)外專利就多達(dá)幾十份。2023/2/5

目前國(guó)外有日本、匈牙利、美國(guó)、俄羅斯的多家公司申請(qǐng)了關(guān)于番茄紅素生產(chǎn)專利，但只有從鮮番茄中提取番茄紅素的工藝在以色列LycoredNaturalProductsIndustriesLtd實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化大規(guī)模的生產(chǎn)。而中國(guó)的番茄紅素開發(fā)亦被納入“國(guó)家863計(jì)劃”，受到的高度重視。

我國(guó)番茄紅素的生產(chǎn)和研究均處于起步階段。其研究主要集中在北京化工大學(xué)和無錫輕工大學(xué)食品學(xué)院；現(xiàn)有廠家的生產(chǎn)技術(shù)均以天然番茄為原料，如新疆生命紅科技公司、上海的中國(guó)華源集團(tuán)有限公司等有限幾家企業(yè)，而華北制藥是全國(guó)第一家采用生物發(fā)酵法提取番茄紅素的企業(yè)。另據(jù)報(bào)道由江南大學(xué)和鹽城市瑞智生物技術(shù)有限公司共同研制、開發(fā)的高科技產(chǎn)品天然番茄紅素膠囊目前也已投入批量生產(chǎn)。

番茄紅素的生產(chǎn)工藝2023/2/5生產(chǎn)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)天然產(chǎn)物提取法天然、綠色、無毒原料來源有很大局限性，生產(chǎn)成本高，不能規(guī)模化生產(chǎn)化學(xué)合成法成本低，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單溶劑和重金屬殘留量高，過量食用有毒副作用微生物發(fā)酵法天然、綠色、無溶劑殘留、無重金屬殘留；生產(chǎn)成本低、工藝簡(jiǎn)單、周期短、產(chǎn)量高；體內(nèi)吸收率高多集中在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究還未跟進(jìn)合成番茄紅素的微生物

迄今研究發(fā)現(xiàn)，能夠生產(chǎn)番茄紅素的微生物包括能自身合成番茄紅素的革蘭氏陰性菌、真菌、藻類以及基因工程菌。2023/2/5三孢布拉氏霉菌

三孢布拉氏霉菌以其生長(zhǎng)迅速、生物量高、產(chǎn)β-胡蘿卜素能力強(qiáng)在發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素方面展現(xiàn)出較好的工業(yè)化應(yīng)用前景，成為目前唯一能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的一種高產(chǎn)絲狀真菌。2023/2/5三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)

目前三孢布拉霉的篩選多采用誘變育種和構(gòu)建基因工程菌的方法。

誘變育種:

常規(guī)的物理和化學(xué)誘變方法有紫外、60Co、激光、亞硝基胍、硫酸二乙酯等。缺點(diǎn)：

細(xì)胞很難表現(xiàn)出正突變效果,

菌種的生產(chǎn)性狀不穩(wěn)定,

番茄紅素的產(chǎn)量低。

2023/2/51

菌種選育三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)1

菌種選育基因工程技術(shù):1990年Norihiko等報(bào)道在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了六個(gè)與類胡蘿卜素合成有關(guān)的基因，分別是CrtE,CrtX,CrtY,CrtI,CrtB和CrtZ，其中CrtE,CrtI和CrtB與番茄紅素的合成有關(guān)，其參與番茄紅素的合成途徑如下所示[3]:FPPCrtEGGPPCrtB八氫番茄紅素CrtI番茄紅素基因工程技術(shù):

構(gòu)建基因工程菌的思路：在一些能夠合成法尼基焦磷酸(FPP)的微生物中插入上述基因，使重組子能夠合成類胡蘿卜素。

美國(guó)專利報(bào)道將控制番茄紅素合成的基因crtE,crtB,crtI轉(zhuǎn)入擬分枝孢鐮刀菌,得到0.5mg/g細(xì)胞干重的番茄紅素[1]。Wang等[2]通過對(duì)紅假單孢球菌(Rhodobactersphaeroides)中八氫番茄紅素脫氫酶的基因crtI進(jìn)行定點(diǎn)突變,使番茄紅素的產(chǎn)率提高到90%。[1]JonesJD，HohnTM，LeathersTD，eta1．Fusariumsporotrichioidesstrainsforproductionoflycopene．US：6696282，2004-02-24[2]WangCW，LiaoJC．AlterationofproductspecificityofRhodobactersphaeroidesphytoenedesaturasebydirectedevolution．TheJournalofBiologicalChemistry，2001，276(44)：4461～4464

三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)1

菌種選育

利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模走向小規(guī)模產(chǎn)業(yè)化,但工程細(xì)胞攜帶的質(zhì)粒對(duì)過程控制條件要求苛刻,易脫落,番茄紅素產(chǎn)量大幅降低。在產(chǎn)業(yè)化過程中,研究者更多的傾向于選擇天然生產(chǎn)菌種,如具有較高生產(chǎn)能力的三孢布拉氏霉菌,這樣就可以避免發(fā)酵工程上游技術(shù)中容易遇到的問題。三孢布拉氏霉菌的發(fā)酵生產(chǎn)1

菌種選育2培養(yǎng)基的組成方面

盡可能地利用成分簡(jiǎn)單且價(jià)格低廉的培養(yǎng)基向來是發(fā)酵工程的宗旨，尤其是利用生物質(zhì)原材料，這就涉及到原材料的選擇及處理問題。

趙清等[3]為提高番茄紅素的發(fā)酵水平,篩選了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。并在發(fā)酵過程中補(bǔ)加其所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),得到一個(gè)穩(wěn)定的配方,并對(duì)發(fā)酵過程補(bǔ)料進(jìn)行了優(yōu)化。

最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:玉米淀粉4%;葡萄糖2.0%;黃豆餅粉1%;大豆分離蛋白3%;玉米漿2%;磷酸二氫鉀0.1%;硫酸鎂0.02%;VB10.5%;油5%;BHT0.05%;pH值為7.2。此配方比較穩(wěn)定,平均色素值為1922mg/L。

最終優(yōu)化的中間補(bǔ)料工藝如下:48h補(bǔ)加葡萄糖1.0%,硫酸銨1.0%,磷酸二氫鉀0.1%。此工藝比較穩(wěn)定,平均色素值增加11%。[3].趙清,王葭，張新明等,番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵過程控制的研究.河北工業(yè)科技,2008.25(6):第358-360頁.2023/2/5

pH：LopezNieto

等[4]研究表明,發(fā)酵液初始pH7.5時(shí)利于番茄紅素的積累,但發(fā)酵過程中控制恒定的pH7.5,對(duì)發(fā)酵極為不利。因?yàn)椴徽{(diào)節(jié)pH時(shí),菌體能產(chǎn)生多種有機(jī)酸作為碳源;而調(diào)節(jié)恒定的pH,影響代謝流向。

溫度：產(chǎn)生番茄紅素的最佳溫度為25℃,較高的溫度(28℃~30℃)將會(huì)增加β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素的含量,降低番茄紅素的產(chǎn)量。[4]Lopez-Nieto

M.J，Costa

J，Peiro

E，et

a1．Biotechnoloigcallycopene

production

by

mated

fermentationof

Blakesleatrispora.ApplMicrobiolBiotechnol,2004.66(2):153~1593pH、溫度、攪拌速度和通氣率攪拌速度：

提高攪拌轉(zhuǎn)速能夠在一定程度上提高溶氧速率，但高攪拌轉(zhuǎn)速形成的高剪切力，使得菌體受損，生物活性降低致使生物量減小，僅單純加大通氣量，在發(fā)酵處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，仍然達(dá)不到要求。通氣率:

增加空氣流速,提高空氣中的O2濃度,能夠增加溶氧水平并降低CO2濃度,因此能促進(jìn)番茄紅素的合成。2pH、溫度、攪拌速度和通氣率

Mantzouridou等[5]研究表明在低轉(zhuǎn)速(150r/min)和高通氣率(1.5vvm)時(shí)可以獲得較高的胡蘿卜素產(chǎn)量和生產(chǎn)率;在高轉(zhuǎn)速(500r/min)和中等通氣率下(1vvm),可以獲得較高產(chǎn)率和菌體生物量。2pH、溫度、攪拌速度和通氣率[5]MantzouridouF,RoukasT,KotzekidouP.EffectoftheaerationrateandagitationspeedoncaroteneproductionandmorphologyofBlakesleatrisporainastirredtankreactor:mathematicalmodeling.BiochemicalEngineeringJournal,2002,10:123~1352023/2/53發(fā)酵促進(jìn)劑1.性激素——三孢酸以及結(jié)構(gòu)類似物

三孢酸是一種激素，以β一胡蘿卜素為前體合成，培養(yǎng)基中加入三孢酸可以提高番茄紅素的產(chǎn)量。

通過對(duì)三孢酸結(jié)構(gòu)類似物結(jié)構(gòu)式的分析，可以確定化合物必須具備1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)并帶1個(gè)酮基和1個(gè)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)才具有這種生物活性。例如β-紫羅酮、脫落酸、異煙肼、琥珀酰亞胺、檸檬油萜烯和芳香族化合物的結(jié)構(gòu)類似物也有此性質(zhì)。2.氧載體與表面活性劑

三孢布拉霉是高度嗜氧的微生物，從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面去改善培養(yǎng)介質(zhì)的性能，可以通過添加氧載體、表面活性劑來提高同一反應(yīng)系統(tǒng)的傳氧系數(shù),從而提高番茄紅素的產(chǎn)量。3.番茄紅素環(huán)化酶抑制劑

生物法生產(chǎn)番茄紅素的關(guān)鍵步驟就是添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑，打斷番茄紅素至β一胡蘿卜素的環(huán)化反應(yīng)，使代謝流停留在番茄紅素階段。

常見的番茄紅素環(huán)化酶抑制劑有兩類：叔胺類化合物：主要包括對(duì)二甲氨乙基苯酚、2-二甲氨基乙醇、2一二甲氨基一1一丙醇、1一二甲氨基一2一丙醇、3一二異丙基氨基一1一丙醇、1一二異丙基氨基一2一丙醇、三乙胺、2一二甲氨基乙苯等；

但目前由于毒性較大，在微生物法生產(chǎn)番茄紅素中較少應(yīng)用。含氮類雜環(huán)化合物：如煙堿、咪唑、吡啶、嗎啉、吡啶、哌啶、喹啉和某些取代衍生物。4.麥角固醇合成抑制劑

番茄紅素和麥角固醇的合成前體都是法尼基二磷酸(FPP)，通過控制麥角固醇的合成，來達(dá)到積累番茄紅素的目的。

麥角固醇合成抑制劑,如十二環(huán)嗎啉、嗪氨靈、氟康唑、酮康唑、鹽酸特比萘芬等，抑制合成麥角固醇酶的活性，使得麥角固醇產(chǎn)量降低，從而使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高。

WangJingfeng等[5]對(duì)三孢布拉霉NRRL2895(+)和NRRL2896(-)搖瓶生產(chǎn)番茄紅素發(fā)酵工藝進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，研究發(fā)現(xiàn)正、負(fù)菌株的比例、番茄紅素環(huán)化酶抑制劑砒啶和肌酐、三孢酸結(jié)構(gòu)類似物脫落酸、3-羥基-3-甲基輔酶A(HMG-COA)前體物亮氨酸以及甲羥戊酸激酶激活劑青霉素是影響番茄紅素合成的關(guān)鍵因素。在最佳的發(fā)酵條件下，即發(fā)酵液中正負(fù)株的最佳比例為5:1，發(fā)酵過程中添加6g/L肌酐、0.1g/L青霉素、150μmol/L脫落酸及0.5g/L的亮氨酸，番茄紅素產(chǎn)量可達(dá)(156.2±15.4)mg/L，比優(yōu)化前提高了134.9%。

[5]WANGJinfeng,LIUXiuji,LIURuisang,etal.Optimi