掃描電子顯微鏡樣品制備

掃描電子顯微鏡樣品制備小組成員：裘英華，張國(guó)榮，薛曉波，儲(chǔ)鋼，金志華2010-1-6掃描電鏡相比透射電鏡的一大優(yōu)點(diǎn)：樣品制備簡(jiǎn)單。但不意味著樣品制備可以隨意進(jìn)行。忽視樣品制備，往往影響檢測(cè)結(jié)果。掃描電子顯微鏡的成像是靠觀察物體表面發(fā)射的電子。掃描電子顯微鏡是用聚焦電子束在樣品表面掃描。電子激發(fā)樣品表面的原子放電，釋放出微細(xì)的二次電子，用檢測(cè)裝置可以捕獲它們，然后通過(guò)類似電視機(jī)的原理將樣品圖象呈現(xiàn)出來(lái)。1.掃描電子顯微鏡原理二次電子對(duì)檢測(cè)器的作用取決于樣品表面的性質(zhì)，當(dāng)電子激發(fā)樣品表面突起部位時(shí)，會(huì)有大量二次電子進(jìn)入檢測(cè)器，而表面凹陷處則只有少量二次電子進(jìn)入，所以可以顯出反差突出、明暗清晰的三維圖象。而且它的成像焦深較長(zhǎng)，圖象的立體感強(qiáng)，和肉眼所見(jiàn)差別不大。制備掃描電子顯微鏡的樣品也先要經(jīng)過(guò)固定、脫水等處理，以免在真空條件下變形失真，為了獲得較多的二次電子，表面要噴涂重金屬和碳原子。2.

對(duì)樣品要求不會(huì)被電子束分解。在電子束掃描下熱穩(wěn)定性要好。能提供導(dǎo)電和導(dǎo)熱通道。大小與厚度要適于樣品臺(tái)的安裝。觀察面應(yīng)該清潔，無(wú)污染物。進(jìn)行微區(qū)成分分析的表面應(yīng)平整。3.

介紹幾種樣品制備方法塊狀樣品粉末樣品生物樣品3.1

塊狀樣品制備塊狀試樣掃描電鏡的試樣制備是比較簡(jiǎn)便的。對(duì)于塊狀導(dǎo)電材料，除了大小要適合儀器樣品座尺寸外，基本上不需要進(jìn)行什么制備，用導(dǎo)電膠把試樣粘結(jié)在樣品座上，即可放在掃描電鏡中觀察。對(duì)于塊狀的非導(dǎo)電或?qū)щ娦暂^差的材料，要先進(jìn)行鍍膜處理，在材料表面形成一層導(dǎo)電膜。以避免電荷積累，影響圖象質(zhì)量。并可防止試樣的熱損傷。

試樣與樣品座的粘結(jié)情況(b)合理粘結(jié)(a)

不合理粘結(jié)蒸鍍膜試樣

粘結(jié)劑試樣座對(duì)于金屬、巖礦或無(wú)機(jī)物，切割成要求的尺寸，粘在樣品臺(tái)上。如果樣品數(shù)量多，注意樣品尺寸最好一致。微區(qū)成分分析樣品表面應(yīng)該平坦或經(jīng)研磨拋光，可以保證檢測(cè)時(shí)幾何條件不變。對(duì)于樣品的斷口面，要選擇起伏不大的部位，最好是分析點(diǎn)附近有小的平坦區(qū)。樣品表面和底面應(yīng)該平行。3.2

粉末樣品制備1直接撒粉法

將粉末直接撒在清潔光亮的樣品臺(tái)上,滴一滴0.5%火棉膠醋酸戊脂溶液于試樣邊沿,火棉膠液立即浸潤(rùn)粉末,再把試樣臺(tái)水平輕輕晃動(dòng)幾下,使試樣分布平整、均勻,并用電熱風(fēng)吹干,粉末固定在樣品臺(tái)上即可放入電鏡內(nèi)進(jìn)行觀察。

優(yōu)點(diǎn)：制樣方法簡(jiǎn)單,但均勻性差,適應(yīng)于一般要求的粗顆粒樣品的觀察。

2導(dǎo)電膠粘結(jié)法

對(duì)于150-500um粉末可采用一薄層導(dǎo)電膠將粉末粘在已拋光的銅樣品臺(tái)上,其基本做法是先在樣品臺(tái)上均勻涂上一層導(dǎo)電膠(Ag膠、石墨孔膠等),然后將粉末撒在上面,把試樣臺(tái)面朝下使不與膠層接觸的粉粒脫落,這樣,在表面留下被導(dǎo)電膠粘結(jié)的均勻一層。

制樣的關(guān)鍵：導(dǎo)電膠涂敷要均勻,平整,盡可能薄一些,否則會(huì)造成視場(chǎng)起伏或顆粒下陷于膠體內(nèi),造成立體失真。3溶液均勻法

細(xì)粉末的分散好壞是決定測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。當(dāng)粉末粒子為0.5-4um或小于0.5um時(shí),其表面活性很大,常常是以互相粘附的二次粒子狀態(tài)存在。

將粉末顆粒放在酒精或乙醚等清潔且又不與粉末發(fā)生反應(yīng)的溶劑中,加入少許分散劑(偏磷酸鈉等),并均勻搖動(dòng)或用超聲波振蕩器和手動(dòng)攪拌器結(jié)合等分散方式,使其分散均勻。用吸管將含粉粒的溶液滴到清潔光亮的樣品臺(tái)上,再用一根小小的木棒粘上少許酒精在樣品臺(tái)表面上留下一層較均勻的粉粒,滴一滴0.5%火棉膠醋酸戊脂溶液于試樣邊沿,并用電熱風(fēng)吹干即可放入電鏡內(nèi)進(jìn)行觀察,這種方法特別適合于觀察單顆粒的細(xì)微粒子。3.3

生物樣品制備超薄切片實(shí)際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察切片后所拍攝的顯微照片時(shí)，容易造成錯(cuò)誤的印象，用掃描電子顯微鏡(SEM)能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實(shí)地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形態(tài)特征。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等雜物，妨礙著觀察，以致造成對(duì)圖像的錯(cuò)誤解釋，所以，在固定前都必須特別做好表面的清潔工作。葡萄球菌的細(xì)胞表面紅血球具體制備步驟1、取材

一般原則與超薄切片相似，但用于掃描電鏡觀察的樣品塊略大，通常為5mm×8mm左右。

2、清洗、固定

鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入磷酸鹽緩沖液（PBS）中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加4℃預(yù)冷的3%戊二醛，在4℃固定2h或過(guò)夜，吸出固定劑，用PBS浸洗2次，每次10min，再用4℃預(yù)冷的1%鋨酸。在4℃固定1h，然后用PBS浸洗2次，每次10min。3、脫水

丙酮/醋酸異戊酯(1:1)脫水10min，接下來(lái)醋酸異戊酯脫水30min，或用系列梯度酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每種濃度酒精通過(guò)2次，每次15min。4、干燥

以臨界干燥法最理想，但必須要有專門(mén)的儀器，只需使用儀器干燥即可。一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來(lái)源的干燥方法。這種方法由于沒(méi)有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷。

當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時(shí)，可采用乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。將樣品浸入520%的乙腈溶液中，然后依次更換70%、80%、90%、95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡15-20min，最后再換100%乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。5、樣品導(dǎo)電處理

將干燥的樣品用導(dǎo)電性好的粘合劑或其他粘合劑粘在金屬樣品臺(tái)上，用真空噴鍍法。4.鍍膜樣品不導(dǎo)電，在電子束連續(xù)掃描下，表面會(huì)積累負(fù)電荷，使樣品表面形成一個(gè)較強(qiáng)的負(fù)電位，這是充電現(xiàn)象。樣品的負(fù)電位抵消掉入射電子部分能量，負(fù)電位使二次電子發(fā)射和運(yùn)動(dòng)不穩(wěn)定，圖象畸變，亮度變化無(wú)常。導(dǎo)電樣品與樣品臺(tái)粘接不好同樣也會(huì)發(fā)生充電現(xiàn)象。鍍膜材料的要求：導(dǎo)電率好；二次電子產(chǎn)率高；常用Au，Pt或Au-Pd