一液相色譜基礎

液相色譜基礎知識色譜的發(fā)明人俄國科學家：M.S.Tswett正式命名“色譜”的文獻一、色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素玻璃柱經典液相色譜色譜法簡介色譜法（Chromatography）溯源俄國科學加1903年發(fā)現(xiàn)色譜的吸附原理，開創(chuàng)了應用吸附原理分離植物色素的新方法并見諸于俄文的文獻1906年正式命名（見諸文獻）色譜法；Chromatography50年代開始廣泛研究和應用主要是氣相色譜及薄層色譜高效液相色譜法的廣泛應用始于70年代色譜分離的機理色譜是一種分離技術色譜分離是一個物理過程流動相（MobilePhase）固定相（StationaryPhase）樣品（溶解于流動相中的溶質）液相色譜分離機理

高效液相色譜是一種以液體作流動相和固體微粒作固定相，待測組分在柱內的兩相之間進行高速分配和高效分離的柱液體色譜方法。樣品溶液中的各組分，因其物理化學性質的微小差異，當其隨流動相進入色譜柱后，便在柱的兩相之間產生不同的相互作用力，從而導致柱上遷移速率的微小差異。隨著流動相的連續(xù)推移，這種微小的差異被不斷擴大，直至柱內出現(xiàn)明顯不同的遷移距離，使最終達到組分完全分離。什么是液相色譜氣相色譜：流動相是氣相液相色譜：流動相是液相什么是高效液相色譜HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色譜法，簡稱：HPLC是一種區(qū)別于經典液相色譜；基于儀器方法的高效能分離手段：高性能的色譜柱，高精度、耐高壓的輸液泵以及高靈敏度的檢測器……廣泛應用于各個領域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學/食品及農業(yè)……在技術，理論及應用上仍處于發(fā)展階段液相色譜的基本流程圖流動相

泵色譜柱檢測器

泵輸液分離

檢測

記錄AEGBCDF進樣閥進樣HPLC的儀器配置色譜泵自動進樣器色譜柱及柱溫箱檢測器數(shù)據處理系統(tǒng)溶劑高效液相色譜基本概念＊色譜峰或色譜譜帶＊基線噪音＊基線漂移＊檢測限（敏感度）＊色譜峰對稱性＊色譜定性參數(shù)＊色譜柱效能參數(shù)液相色譜圖相關術語色譜峰－Peak色譜柱流出組分通過檢測器時產生的響應信號的微分曲線峰底－PeakBase峰的起點與終點之間連接的直線峰高－PeakHeight峰最大值到峰底的距離峰寬－PeakWidth在峰兩側拐點處所作切線與峰底相交兩點之間的距離半（高）峰寬－PeakWidthatHalfHeight通過峰高的中點作平行于峰底的直線，其與峰兩側相交兩點之間的距離液相色譜圖相關術語峰面積－PeakArea峰與峰底之間的面積,又稱響應值標準偏差；σ－StandardError0.607倍峰高處所對應峰寬的一半拖尾峰－TailingPeak后沿較前沿平緩的不對稱峰前伸峰－LeadingPeak前沿較后沿平緩的不對稱峰鬼峰－GhostPeak并非由試樣所產生的峰；亦稱假峰液相色譜圖相關術語基線－Baseline在正常操作條件下，僅由流動相所產生的響應信號的曲線基線飄移－BaselineDrift基線隨時間定向的緩慢變化基線噪聲；N－BaselineNoise由各種因素所引起的基線波動譜帶擴展－BandBroadening由于縱向擴散,傳質阻力等因素的影響,使組分在色譜柱內移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象液相色譜圖相關術語死時間，t0

－Deadtime不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間保留時間，tR

－Retentiontime組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間死體積，V0

－Deadvolume不被固定相滯留的組分，從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積保留體積，VR

－Retentionvolume組分從進樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積液相色譜實驗所需的基本參數(shù)

液相色譜實驗所需的基本參數(shù)流動相：種類及配比，等度或梯度固定相：色譜柱類型及內徑、長短流動相輸送系統(tǒng)參數(shù)：流速檢測器參數(shù)：紫外檢測波長，靈敏度等溫度控制進樣量以上參數(shù)即構成一個具體的HPLC方法，亦稱色譜條件色譜圖：HPLC圖形結果

（Chromatogram）色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為信號強度，橫坐標為保留時間?！V峰保留時間（分）基線↓峰高峰寬響應值色譜峰或色譜譜帶流出曲線上的突起部分稱為色譜峰正常色譜峰為對稱形正態(tài)分布曲線不對稱色譜峰有兩種：前延峰和拖尾峰色譜流出曲線圖及相關參數(shù)

樣品進入色譜柱，經流動相沖洗，由檢測器測得的信號-洗脫時間曲線，即色譜圖。檢測限（敏感度）常用基線噪音的二倍表示：D=2·N/S

式中：

N

為噪音（mV)

S

為靈敏度(mV·ml/g)對稱因子計算示意圖色譜峰的對稱性—對稱因子：

a.

拖尾因子

b.

不對稱因子峰對稱因子計算公式對稱因子(fs)：式中：

fs=0.95~1.05為正常峰

fs＜0.95為前延峰

fs＞1.05為拖尾峰色譜柱效能參數(shù)計算示意圖色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5s理論板數(shù)(n)計算公式或（通常用）：若應用調整保留時間tR′計算理論塔板數(shù)，所得值稱為有效理論塔板數(shù)(

n有效或neff

)液相色譜中的相平衡參數(shù)

分配系數(shù)（K）

容量因子（k）

選擇性因子（）分配系數(shù)(K)計算公式在一定溫度下，系統(tǒng)達到分配平衡時，組分在固定相中的濃度（Cs

)與在流動相中的濃度（Cm)之比：容量因子(k)計算公式

容量因子亦指系統(tǒng)在達到分配平衡后，組分在固定相中的量（Ws）與在流動相中的量（Wm）之比，k=tR-t0／t0

k值

k項

k對分離度影響

00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95容量因子k與分離度的關系與R的關系容量因子k

與峰高的關系改變k’

值的方法：調節(jié)流動相的極性（比例）、pH、離子強度等梯度淋洗選擇性因子()計算公式

兩相鄰組分的分配系數(shù)之比或容量因子之比稱為選擇性因子（）。要使兩組分獲得分離，≠1。否則，兩相鄰組分沒有分離。或把

k=tR′／t0代入得：選擇性系數(shù)a定義∶

a=1時兩組分分不開，改變a的途徑改變固定相改變流動相（組成）改變溫度改變樣品的本身性質分離度(R）計算方法示意圖分離度(R）計算公式⑴

R=1，稱為4

分離，(峰尖間距為4)，兩相鄰峰基本分離，達95.4%。⑵

R=1.5,為6

分離，分