獸殘分析中樣品的采集、保存、制備與前處理技術(shù)及方法建立步驟

1獸殘分析中樣品的采集、保存、制備與前處理技術(shù)及方法建立步驟王永娟2殘留分析的樣品樣品的前處理殘留檢測(cè)方法采樣與樣品制備（樣品預(yù)處理）提取凈化濃縮衍生化分辨檢測(cè)樣品處理測(cè)定分離殘留分析原理獸藥殘留分析的過程31樣品的采集、保存、制備1.1采樣1.2樣品封存1.3樣品的保存運(yùn)輸1.4樣品制備41.1.1抽樣的基本原則嚴(yán)格按照規(guī)定的程序和方法執(zhí)行，確保抽樣工作的公正性和樣品的代表性、真實(shí)性。51.1.2人員抽樣人員不少于2人抽樣人員應(yīng)經(jīng)過專門的培訓(xùn)，具備相應(yīng)資質(zhì)。抽樣人員應(yīng)攜帶身份證、工作證、單位介紹信、抽樣單等文件。61.1.3工具肉類：不銹鋼刀具、自帶封口的食品衛(wèi)生塑料包裝袋、低溫樣品保存箱（盒）、一次性手套、標(biāo)簽、盛放微生物檢驗(yàn)用樣品的滅菌容器等。蛋類：潔凈衛(wèi)生的格狀專用盛蛋盤、樣品保存箱、一次性手套、標(biāo)簽、盛放微生物檢驗(yàn)用樣品的滅菌容器等。奶類：攪拌棒、取樣器、溫度計(jì)、塑料密封采樣瓶、低溫存奶箱、一次性手套、標(biāo)簽、盛放微生物檢驗(yàn)用樣品的滅菌容器等。蜂蜜：取樣桿，取樣瓶、一次性手套、標(biāo)簽、盛放微生物檢驗(yàn)用樣品的滅菌容器等。71.1.4組批飼養(yǎng)場(chǎng)：以同一養(yǎng)殖場(chǎng)、養(yǎng)殖條件相同、同一天或同一時(shí)段生產(chǎn)的產(chǎn)品為一檢驗(yàn)批。屠宰場(chǎng)：以來源于同一地區(qū)、同一養(yǎng)殖場(chǎng)、同一時(shí)段屠宰的動(dòng)物為一檢驗(yàn)批。冷凍（冷藏）庫：以企業(yè)明示的批號(hào)為一檢驗(yàn)批。市場(chǎng)：以產(chǎn)品明示的批號(hào)為一檢驗(yàn)批。81.1.5一個(gè)樣品的組成及取樣量血樣：從頸靜脈或前腔靜脈取全血加抗凝劑。取樣量為牛：50～100ml；羊和豬：20～50ml。尿樣：收集清晨飼喂前的尿液100～200ml。蛋：從產(chǎn)蛋架上抽取，取樣量不少于10枚；奶：從全場(chǎng)混合奶中取，取樣量不少于1000ml。蜂蜜：每個(gè)樣品量為1000克91.1.5一個(gè)組織樣品的組成動(dòng)物肌肉肝腎脂肪牛300-500克400-500克(取整葉)雙腎各取1/2（縱切）200克羊300-500克400-500克(取整葉)雙腎各取1/2（縱切）200克豬300-500克400-500克(取整葉)雙腎各取1/2（縱切）200克雞300-500克200-500克(取6只雞全肝)6只雞全腎50-100克(6只雞脂肪)兔300-500克400-500克(取5只兔全肝)5只兔全腎5只兔脂肪101.1.6養(yǎng)殖場(chǎng)抽樣數(shù)量豬、羊（尿樣、血液）動(dòng)物數(shù)量（樣本數(shù)）抽樣數(shù)（個(gè)）5055110081015001250015111.1.6養(yǎng)殖場(chǎng)抽樣數(shù)量牛（尿樣、血液、奶）動(dòng)物數(shù)量（樣本數(shù)）抽樣數(shù)（個(gè)）5003501100071001500010500110000121000015121.1.6養(yǎng)殖場(chǎng)抽樣數(shù)量家禽（蛋）動(dòng)物數(shù)量（樣本數(shù)，只）抽樣數(shù)（個(gè)）100011001500035001100005100008131.1.6養(yǎng)殖場(chǎng)抽樣數(shù)量-蜂蜜從每個(gè)蜂場(chǎng)抽取10％的蜂群，每一群隨機(jī)取1張未封蜂坯，用分蜜機(jī)分離后取1000g。141.1.7屠宰廠抽樣（動(dòng)物組織）數(shù)量家畜（豬、羊）動(dòng)物數(shù)量（樣本數(shù)，頭）抽樣數(shù)（個(gè)）10051015008501200010200015151.1.7屠宰廠抽樣（動(dòng)物組織）數(shù)量家禽（雞、鴨、鵝）、兔動(dòng)物數(shù)量（樣本數(shù)，只）抽樣數(shù)（個(gè)）100011001500035001100005100008161.1.8蜂蜜加工廠（場(chǎng)）取樣批量（件）最低取樣數(shù)（件）＜50550－10010101－500每增加100，增取5＞501每增加100，增取2171.1.9市場(chǎng)樣品采集鮮肉若成堆產(chǎn)品，則在堆放空間的四角和中間設(shè)采樣點(diǎn)，每點(diǎn)從上、中、下三層取若干小塊混為一份樣品；若零散產(chǎn)品，則隨機(jī)從3～5片胴體上取若干小塊混為一份樣品。每份500～1500克。凍肉小包裝凍肉同批同質(zhì)隨機(jī)取3～5包混合，總量不得少于1000克。若成堆產(chǎn)品，取樣方法同鮮肉。18雞蛋按批次分別在貨件不同部位隨機(jī)抽樣在50件以內(nèi)者，抽檢2件；50至100件者，抽檢4件；101至500件者，每增加50件增抽1件（所增不足50件者，按50件計(jì)）；500件以上者，每增加100件增抽1件（所增不足100件者，按100件計(jì)算）。19液體乳品一般可采用虹吸法，或者用簡(jiǎn)單的玻璃管按不同深度分層取樣。對(duì)于黏稠或含有固體懸浮或非均勻乳品應(yīng)充分?jǐn)噭?，然后再進(jìn)行取樣?？偭繎?yīng)不少于500克。小包裝、玻璃瓶裝乳品按取樣數(shù)量將內(nèi)容物連同包裝一起采樣。均可以按照每一生產(chǎn)班次，或同一批號(hào)的產(chǎn)品，隨機(jī)抽取原包裝乳品2～4包/瓶。1.1.9市場(chǎng)樣品采集20冷庫、市場(chǎng)抽樣數(shù)量檢驗(yàn)批量（件）最少取樣數(shù)（件）1-25126-1005101-25010251-50015501-1000171001-25002021組織樣品的取樣取樣時(shí)不得將待取樣品和已取樣品進(jìn)行任何洗滌處理，取樣時(shí)用不銹鋼手術(shù)剪或手術(shù)刀割取樣品，戴一次性塑料手套操作。221.1.10縮分小樣為保證樣品檢驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性或能進(jìn)一步仲裁，每個(gè)樣品都應(yīng)分成至少兩個(gè)相同的小樣，每個(gè)小樣的數(shù)量都能滿足每次進(jìn)行完整分析的需要。分樣可以在采樣點(diǎn)或檢驗(yàn)部門的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。分樣時(shí)，必須避免污染或任何能引起殘留物含量變化因素的產(chǎn)生。231.1.11抽樣單填寫樣品編號(hào)：格式為[動(dòng)物品種代碼]/[樣品種類代碼]/[抽樣日期]。例：2001年7月10日抽取的牛肝樣品第一份，其編號(hào)為：B/L/010710-1。代碼動(dòng)物品種牛羊豬雞兔魚蜂蜜代碼BOPCRFBe樣品種類肌肉脂肪肝腎血液尿液蛋代碼MFLKBUE樣品種類奶蜂蜜心肺腦皮膚毛發(fā)代碼MiHbHLuCSHa25采樣單填寫樣品名稱：所取樣品的種類及部位。例：血樣，全肝，背脊肉等。動(dòng)物品種：所取樣品動(dòng)物的名稱。年齡：牛、羊按年計(jì)，豬按月計(jì)，兔、雞按日計(jì)。抽樣基數(shù)：抽樣當(dāng)天的出欄率（養(yǎng)殖場(chǎng)）、屠宰量（屠宰廠）、存貨量（冷庫）。樣本數(shù)量：所取樣品的重量或體積。批號(hào)：樣品所在批的批號(hào)，若無，則填“無”。保存情況：運(yùn)輸前所采取的保存方式、保存溫度及持續(xù)時(shí)間。采樣機(jī)構(gòu)(蓋章)采樣人(簽字)；采樣日期；被采樣單位負(fù)責(zé)人簽名。26填寫采樣單的注意事項(xiàng)采樣單填寫的內(nèi)容應(yīng)真實(shí)、詳實(shí)；應(yīng)采用黑色鋼筆或簽字筆填寫，字跡清楚，不潦草，不得涂改；采樣單應(yīng)填寫完整，在采樣人一欄至少應(yīng)有兩名采樣人簽字。填寫抽樣單最少一式三份，分別由抽樣單位、被抽樣單位（隨留樣保存）和行政主管部門各1份.271.2樣品封存抽樣人員和被檢單位代表共同確認(rèn)樣品的真實(shí)性、代表性和有效性。將每份樣品分別封存，粘貼封條。抽樣人員和被檢單位代表分別在封條上簽字蓋章。封樣包裝材料應(yīng)清潔、干燥，不會(huì)對(duì)樣品造成污染和傷害；包裝容器應(yīng)完整、結(jié)實(shí)、有一定抗壓性。281.3樣品保存運(yùn)輸為確保被分析物的穩(wěn)定性和樣品的完整性，采集的樣品應(yīng)由專人妥善保存，并在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)送達(dá)檢測(cè)單位。取樣后凍肉樣應(yīng)在冷凍狀態(tài)下保存，蜂蜜：-10℃，禽蛋：0～4℃，牛奶：2～6℃條件下儲(chǔ)存。生鮮樣品取樣后應(yīng)在0℃～4℃條件下24小時(shí)內(nèi)送達(dá)檢測(cè)單位。運(yùn)輸工具應(yīng)保持清潔無污染。防止貯存地點(diǎn)和裝卸地點(diǎn)可造成的污染。291.4樣品制備又稱為樣品預(yù)處理，主要指采樣后至化學(xué)分析前試樣的準(zhǔn)備工作。不屬于化學(xué)分析過程，僅是采樣工作的繼續(xù)。包括樣品勻化、縮分、過篩、離心、過濾、防腐和抑制降解等過程。301.4.1樣品的制備液體、漿體或懸浮液體:一般是將樣品充分混勻攪拌。常用的攪拌工具有玻璃捧、電動(dòng)攪拌器、液體采樣器?；ゲ幌嗳艿囊后w:如油與水的混合物，分離后分別采取。固體樣品:應(yīng)先破碎或切分，然后搗碎、研磨或用其他方法研細(xì)、搗勻。常用工具有絞肉機(jī)、磨粉機(jī)、研缽、高速組織搗碎機(jī)等。罐頭類:肉、魚類罐頭應(yīng)預(yù)先清除骨頭、調(diào)味料（蔥、辣椒等）后再搗碎，常用高速組織搗碎機(jī)等。在制備過程中，應(yīng)注意防止樣品制備中易揮發(fā)性成分的逸散、避免樣品制備中樣品組成成分及理化性質(zhì)發(fā)生變化、防止樣品制備中的操作不當(dāng)造成污染，而影響檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。311.4.2制樣程序領(lǐng)取樣品:從相關(guān)部門領(lǐng)取需要制備的樣品，觀察樣品是否完好，如有腐敗、變質(zhì)、破損等非正常情況，應(yīng)及時(shí)向發(fā)樣部門反映，并停止制樣，保存樣品。如樣品完好，則可開始制備樣品。制備樣品:根據(jù)樣品性質(zhì)、狀態(tài)，選擇適當(dāng)?shù)闹苽浞椒ㄖ苽錁悠?。填寫制樣?樣品制備完畢后，應(yīng)認(rèn)真填寫制樣單，記錄制樣過程，制樣單的內(nèi)容包括：樣品名稱、樣品狀態(tài)、制樣時(shí)間、制樣間溫度等。存放樣品:制樣單填寫完畢后，制備的樣品應(yīng)交與檢測(cè)人員檢測(cè)或放入指定地點(diǎn)保存以供檢測(cè)人員檢測(cè)取用。322樣品前處理2.1概述2.2提取方法2.3凈化方法2.4濃縮與富集2.5化學(xué)衍生化技術(shù)332.1樣品處理-概述目的:將待測(cè)組分從樣品基質(zhì)中分離出來，并達(dá)到儀器能夠檢測(cè)的狀態(tài)。主要作用包括:將藥物從樣品中釋放出來、除去樣品中的干擾雜質(zhì)、將待測(cè)組分轉(zhuǎn)換為可檢測(cè)的形式、達(dá)到可檢測(cè)的濃度范圍和溶于可進(jìn)行分析的介質(zhì)。主要包括四項(xiàng)基本內(nèi)容：提取、凈化、濃縮、衍生化。分離或組分轉(zhuǎn)移是貫穿整個(gè)樣品處理過程的基本問題：液-液萃取、固相萃取34樣品處理-概述實(shí)際中每個(gè)處理步驟和方法不是固定和孤立的，在程序或作用上有時(shí)看不出明顯界限。如固相萃取可用于提取、凈化、濃縮和富集；濃縮既是提高組分濃度的手段，又是溶劑轉(zhuǎn)移和提高萃取效率的常用方法。樣品處理技術(shù)涉及因素多，操作復(fù)雜，方法靈活，直接影響個(gè)分析指標(biāo)、成本和效率，一般占用70%以上的分析工作量。352.2提取方法提?。╡xtraction)：用物理的或化學(xué)的手段破壞待測(cè)組分與樣品成分間的結(jié)合力，將待測(cè)組分從樣品中釋放出來并轉(zhuǎn)移到易于分析的溶液狀態(tài)。提取平衡：待測(cè)物、樣品基質(zhì)、溶劑相似相溶原理提取過程首先應(yīng)保證最大回收率，其次是減少樣品基質(zhì)的共萃取提取過程常與樣品制備過程一同進(jìn)行，如勻漿、抑制樣品降解。362.2.1樣品類型尿液：不會(huì)乳化，但成分復(fù)雜，不穩(wěn)定，與組織濃度相關(guān)性差，分析前需調(diào)節(jié)pH值和水解軛合物，pH4-9。血漿：主要成分為水(90-93%)和可溶性蛋白(7%)。血漿成分較尿液復(fù)雜，組成和性質(zhì)比較穩(wěn)定，血藥濃度與組織濃度密切相關(guān)，pH7.24-7.54。膽汁：成分復(fù)雜且不穩(wěn)定，與尿液相似，分析前需調(diào)節(jié)pH值和水解軛合物，pH6.1-8.6，水分80-96%。奶：主要成分為水（87%）、蛋白質(zhì)（3.3%）、脂肪（3.7%）、糖類（4.7%），可稱為混懸有脂肪微粒的血漿，pH6.7。蛋：蛋黃主要成分為水（50%）、蛋白質(zhì)（16.5%）、脂肪（33%）、糖類，為疏水性環(huán)境，極性低的藥物殘留多，pH6.0-6.8；蛋清主要為水（88%）和蛋白質(zhì)（10.5%）。分析前需調(diào)節(jié)pH值，pH7.5-9.4。動(dòng)物組織：肌肉的主要成分為水（75%）、蛋白質(zhì)（19%）、脂肪（2.5%）、糖類（1.2%），pH5.7。不同動(dòng)物肌肉成分有差異。肝、腎為藥物的代謝或排泄器官，殘留物濃度高，消除緩慢。372.2.2提取溶劑的選擇遵循相似相溶的原則對(duì)待測(cè)組分溶解度大對(duì)于干擾雜質(zhì)溶解度小與樣本基質(zhì)有較好的相容性能有效釋放藥物具有脫蛋白和/或脫脂肪能力其他：沸點(diǎn)適中、黏度小、毒性低、易純化、價(jià)格低廉、易于進(jìn)一步凈化。38常用提取溶劑乙腈、甲醇、丙酮：與樣品容易混合；易于操作；溶劑化作用和滲透能力強(qiáng)，黏度小，提取速度快；能使結(jié)合態(tài)的藥物釋放；脫蛋白和脂肪；提取液pH可以調(diào)節(jié)；帶測(cè)組分在提取樣品液中均勻分布；可定量移取提取液進(jìn)行分析?；旌先軇阂译?甲醇、氯仿-甲醇、乙腈-水、己烷-丙酮等。二甲基亞砜、二甲基甲酰胺：沸點(diǎn)高，凈化中難以除去。非水溶性的極性溶劑：乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、乙醚：脂溶性殘留物無水硫酸鈉：通過鹽析作用提高組織樣品待測(cè)物的回收率。392.2.3提取方法如何提高提取速度？提高樣品的破碎程度，以增加擴(kuò)散面積，減少擴(kuò)散距離攪拌和重復(fù)提取延長(zhǎng)提取時(shí)間使用黏度小的溶劑，適當(dāng)提高溫度402.2.3提取方法

組織搗碎法:又稱勻漿提取法,一般將樣品和3-5倍樣品體積的溶劑加入搗碎杯,高速攪拌或勻漿。將樣品過濾或離心后移取提取液，殘?jiān)貜?fù)提取1-2次，合并提取液進(jìn)行凈化。不需要加熱，速度快，提取效果好。41振蕩法：將樣品和適量溶劑加入具塞錐形瓶，中速振蕩30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，樣品液過濾或離心后移取提取液即可。該方法操作簡(jiǎn)便，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行提取。常加無水硫酸鈉以提高回收率。2.2.3提取方法42索氏提取法：使用索氏提取器進(jìn)行提取。要考慮組分的熱穩(wěn)定性，保證組分在長(zhǎng)時(shí)間回流過程中不分解。該方法操作簡(jiǎn)便，不需要轉(zhuǎn)移樣品，不受樣品基質(zhì)影響，是一種徹底提取法。但提取時(shí)間長(zhǎng)，耗用較多溶劑（每個(gè)樣品300-500毫升），需要對(duì)提取液進(jìn)行濃縮。適用于水分較少的樣品的提取。2.2.3提取方法43超聲波輔助提?。簩悠泛腿軇┓庞诿荛]的試管中，置于具有一定能量的超聲波水浴中，數(shù)秒鐘拿出，再放入、拿出。該方法操作簡(jiǎn)單、一次可同時(shí)提取多個(gè)樣品。提取時(shí)間短、速度快、提取效率高。但要耗用大量的溶劑每個(gè)樣品（300-500毫升），。2.2.3提取方法44超臨界流體萃?。菏褂贸R界流體萃取儀原理：超臨界流體為兼具氣態(tài)和液態(tài)性質(zhì)的特殊狀態(tài)，萃取的速度快。特點(diǎn)：速度快，選擇性強(qiáng)，易于凈化。獲得的樣品可以直接進(jìn)行分析，如進(jìn)行GC或HPLC測(cè)定等。2.2.3提取方法45強(qiáng)化溶劑萃取：是由超臨界流體萃取衍生出來的一種提取方法。采用溶劑作流體，在高溫、高壓下提取樣品。其操作溫度比索氏提取發(fā)高，從而使溶劑具有更強(qiáng)的溶解能力。與索氏提取相比，速度快（10-20分鐘），溶劑用量?。?5毫升）。設(shè)備價(jià)格昂貴。2.2.3提取方法46微波輔助萃取：需要微波萃取裝置。提高萃取效率：微波激活作用、提高溶劑活性2.2.3提取方法47樣品的消解：主要用于常規(guī)方法無法提取的樣品基質(zhì)（毛發(fā)、角質(zhì)、骨頭等）、組織結(jié)合力強(qiáng)的組分、結(jié)合殘留或軛合殘留物的處理酸消解法：對(duì)耐酸的藥物如有機(jī)氯農(nóng)藥。消解試劑如高氯酸-冰乙酸混合液、稀鹽酸等。溫度在80-90℃。消解開始時(shí)應(yīng)充分振蕩或攪拌，是樣品分散。試劑用量一般為樣品量的2-3倍。堿消解法：主要用于動(dòng)物樣品的消解，如魚肉、蛋、奶制品等。試劑有甲醇鈉、乙醇鈉、甲醇鉀、乙醇鉀。溫度為60度。樣品易發(fā)生乳化。酶消解法：主要用于組織蛋白、軛合物和結(jié)合物的水解，使藥物被釋放。常用的蛋白水解酶為枯草桿菌溶素和胰蛋白酶等。軛合物水解沒有β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酶等。酶水解條件溫和，但酶制劑價(jià)格高，水解時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)有更多雜質(zhì)被釋放，加重凈化負(fù)擔(dān)。2.2.3提取方法48冷凍干燥：先將樣品冷凍，置入凍干機(jī)內(nèi)進(jìn)行減壓干燥，除去揮發(fā)性雜質(zhì)，向殘?jiān)屑尤胗袡C(jī)溶劑進(jìn)行萃取。適用于含水樣品中熱穩(wěn)定性差、水溶性的組分的預(yù)處理。制備“干混合物”：將樣品與足量的無水硫酸鈉或硫酸鎂混合研磨，然后用溶劑萃取或裝柱淋洗。起泡分離：利用泡沫除去溶解的物質(zhì)，常用于濃縮和分離水中的洗滌劑后其他表面活性劑。2.2.3提取方法492.2.4提取效率使用同位素標(biāo)記的組分進(jìn)行回收率試驗(yàn)使用公認(rèn)的徹底提取法比較測(cè)定結(jié)果選定方法的比較與重復(fù)502.3凈化方法提取過程中許多與待測(cè)組分溶解性相似的雜質(zhì)被一起轉(zhuǎn)移出來。將待測(cè)組分與雜質(zhì)分離的過程。提取過程一般可以除去99%以上的樣品基質(zhì)，不到1%的共萃取物是主要的干擾物質(zhì)。雜質(zhì)：增加基線噪音、降低柱效、阻塞色譜管路、污染色譜柱和檢測(cè)器?；蚋蓴_色譜分離過程，導(dǎo)致待測(cè)物峰形異常和保留值變異增加。還可能影響衍生化反應(yīng)。雜質(zhì)的存在將直接影響定性和定量的質(zhì)量，使檢測(cè)限升高和變異增加。512.3.1液-液萃取是一種利用待測(cè)組分與樣品雜質(zhì)在互不相溶的兩相中溶解性差異進(jìn)行凈化的方法。原理：分配常數(shù)影響因素：溶劑、pH、離子對(duì)試劑、鹽析、其他操作方法：分液漏斗震蕩法、渦旋萃取、逆逆流萃取、特殊容器萃取等脫水、乳化、吸附損失522.3.2固相萃取優(yōu)點(diǎn)：可以凈化很小體積的樣品、溶劑用量小、選擇性高、速度快、不會(huì)發(fā)生乳化、引入雜質(zhì)少。SPE柱結(jié)構(gòu):柱體、固定相和濾板3部分。固定相類型：正相、反相、離子交換相固定相的選擇：非極性或低極性選用反相固定相，中等極性物質(zhì)反相或正相固定相均可應(yīng)用，離子型或較強(qiáng)的有機(jī)酸、有機(jī)堿可選擇離子交換固定相為保證上樣時(shí)樣品被充分保留，樣品介質(zhì)應(yīng)為弱溶劑。固相萃取分離機(jī)制與溶劑選擇分離機(jī)制弱溶劑（保留條件）強(qiáng)溶劑（洗脫條件）反相水、緩沖液或低濃度的甲醇或乙腈甲醇、乙腈或溶劑與水的混合物正相正己烷、甲苯等二氯甲烷、甲醇等陽離子交換低離子強(qiáng)度緩沖液高離子強(qiáng)度緩沖液低反離子強(qiáng)度高反離子強(qiáng)度pH＞固定相pKapH＜固定相pKapH＜分析物pKapH＞分析物pKa陰離子交換低離子強(qiáng)度緩沖液高離子強(qiáng)度緩沖液低反離子強(qiáng)度高反離子強(qiáng)度pH＜固定相pKapH＞固定相pKapH＞分析物pKapH＜分析物pKa54SPE方法的建立和操作-固定相活化目的是創(chuàng)造一定的溶劑環(huán)境和除去柱內(nèi)雜質(zhì)。一般首先使用一種強(qiáng)洗脫能力的溶劑（始溶劑）潤(rùn)濕和凈化SPE柱，然后再用弱洗脫能力的溶劑（終溶劑）平衡SPE柱。一般每100毫克固定相用1-2毫升溶劑平衡?；罨^程中和上樣前不要讓柱內(nèi)液體流干和空氣進(jìn)入，否則柱床會(huì)出現(xiàn)裂隙，影響回收率、重復(fù)性和凈化效果。終溶劑的強(qiáng)度與樣品溶劑接近或更低，以免樣品被帶出造成回收率下降?；罨瘜?duì)凈化效果十分重要，不當(dāng)?shù)幕罨Ｊ菍?dǎo)致凈化失敗和分析誤差的來源55SPE方法的建立和操作-樣品上柱SPE柱容量一般為固定相中重量的1%-3%。流速越低，凈化效果越好，一般1-10毫升/分鐘。穩(wěn)定的流速對(duì)保證凈化的重復(fù)性是重要的。在保證樣品溶解時(shí)應(yīng)盡可能使用弱溶劑溶解樣品，使組分在柱上有強(qiáng)保留，用較小溶劑體積即可將組分洗脫，也可減少雜質(zhì)流出。樣品的溶劑強(qiáng)度過高或體積過大可能造成穿漏，是回收率降低。有時(shí)樣品必須用強(qiáng)溶劑提取，可用弱溶劑稀釋至適宜的強(qiáng)度。56SPE方法的建立和操作-洗滌、洗脫洗滌：是為了除去不需要的組分或雜質(zhì)，所用溶劑一般略強(qiáng)于或等于樣品溶劑。洗脫：洗脫溶劑必須謹(jǐn)慎選擇，以保證用較小體積的溶劑將組分淋洗下來，并且避免溶劑太強(qiáng)洗出不必要的組分。洗滌或洗脫溶劑的體積一般為0.5-0.8毫升/100毫克。使用混合溶劑是獲得適宜強(qiáng)度溶劑的有效方法。利用洗脫分布圖可以快速選擇溶劑和固定相。572.3.3基質(zhì)固相分散技術(shù)其基本操作是將樣品直接與適量反相鍵合硅膠一起混合和研磨，使樣品被均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態(tài)裝柱，然后用類似與SPE的操作進(jìn)行洗滌和洗脫。樣品與填料的比例通常為1：4特點(diǎn)：處理樣品速度快，溶劑用量少，但樣品量小，要求檢測(cè)方法具有較高的靈敏度。582.3.4免疫親合色譜使用連接有抗體的惰性基質(zhì)作為固定相。對(duì)某種或某類殘留組分選擇性吸附和富集，是殘留分析中有效的凈化方法之一。免疫吸附柱能重復(fù)使用592.3.5制備色譜法包括制備HPLC和TLC制備HPLC通常作為一種補(bǔ)充手段，用于常規(guī)方法難以凈化的樣品或?qū)艋蟾叩姆治龇椒?。將樣品溶液注入制備型液相色譜儀，收集一定時(shí)間段的流出組分，濃縮后測(cè)定。制備TLC凈化中，經(jīng)點(diǎn)樣、展開和干燥后將藥物斑點(diǎn)剝離，用溶劑將藥物浸出，濃縮后測(cè)定。602.3.6其他膜分離技術(shù)分子印跡技術(shù)凝膠滲透色譜固相微量萃?。菏且环N基于液-固吸附平衡的樣品富集方法，是一種無溶劑萃取方法，適用于揮發(fā)性或半揮發(fā)性組分的測(cè)定。吹掃-捕集：是用惰性氣體將液體樣品或樣品提取液中的揮發(fā)性物質(zhì)驅(qū)趕到氣相中，再帶入一個(gè)收集阱中收集后進(jìn)行分析。用于環(huán)境樣品或高脂肪樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的凈化。浸透限制固定相：可選擇性地保留小分子藥物而排除大分子蛋白質(zhì)，達(dá)到凈化和富集的目的?；腔簼饬蛩崤c樣品中的脂肪、油脂、蠟質(zhì)或色素等干擾物質(zhì)反應(yīng)，生成高極性的水溶性產(chǎn)物，經(jīng)有機(jī)溶劑分配后除去。低溫冷凍：動(dòng)物組織中的脂肪、蠟質(zhì)和水分等雜質(zhì)在低溫溶劑中沉淀析出，經(jīng)離心或過濾后除去。凝結(jié)劑沉淀法：將提取液濃縮，樣品溶于丙酮，加入凝結(jié)劑使蛋白、色素等雜質(zhì)沉淀除去，常用于水溶性較高組分的凈化。61膜分離技術(shù)膜分離是利用溶質(zhì)分子的大小、形狀和性質(zhì)等差異，對(duì)薄膜表現(xiàn)不同的通透性而達(dá)到分離或凈化的目的。超濾(ultrafiltration)、滲析(dialysis)、反滲透(reserveosmosis)自動(dòng)序列滲析/痕量富集系統(tǒng)(automatedsequentialtraceenrichmentofdialysates)62也被稱為空間排阻色譜（SEC）。該方法基于尺寸排阻的分離原理，利用樣品中各組分分子大小不同，從而在凝膠中滯留時(shí)間不同而達(dá)到分離目的。凝膠滲透色譜（GPC）不僅可以用于分離和測(cè)定小分子物質(zhì)，而且還可以用于分析具有相同化學(xué)性質(zhì)但分子大小不同的高分子量物質(zhì)。凝膠滲透色譜（GPC）63

分子印跡技術(shù)分自印跡技術(shù)是以目標(biāo)分子為模板，與功能單體通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的方式結(jié)合，再加入交聯(lián)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)。印跡分子(模板)除去后，聚合物中留下了大量的空穴，這些空穴和模板分子在大小及形狀方而完全匹配。即“分子記憶”引入到聚合物中，該聚合物就具有反結(jié)合模板分子的選擇性能。以分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers,MIPs)作為固定相。642.4濃縮與富集旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮：速度快，溶劑可以回收。氣流吹蒸法K-D濃縮器：能使?jié)饪s、回流、洗滌和定容同時(shí)進(jìn)行。真空離心濃縮法：用于熱敏性組分或粘稠液體的濃縮。濃縮過程中組分最易損失，穩(wěn)定性差、蒸汽壓或極性高的待測(cè)物損失更明顯。蒸發(fā)溫度不易過高，吹蒸速度不宜過快，不要將樣品直接蒸干（加入乙二醇、硬脂酸或液體石蠟作為保持劑）。必須干燥時(shí)最后緩緩吹入氮?dú)饣蚩諝狻?52.5化學(xué)衍生化技術(shù)是指通過化學(xué)反應(yīng)使待測(cè)組分定量生成適合于特定分析條件的化合物的一種方法目的：提高檢測(cè)的靈敏度與選擇性；改善色譜分離；提高理化穩(wěn)定性；分離結(jié)構(gòu)相似的組分；輔助定性。要求：反應(yīng)速度快；反應(yīng)易重復(fù)；定量完全；產(chǎn)物易純化；色譜行為良好、易于分離和檢測(cè)662.5.1GC衍生化方法硅烷化:凡結(jié)構(gòu)中含有活潑氫或可烯醇化酮基的化合物均可被硅烷化,常用試劑為三甲基硅烷化試劑,反應(yīng)介質(zhì)一般為甲苯、乙醚、二甲基甲酰胺、乙腈、吡啶。操作用防止帶入水分。酰化：用于羥基、氨基和巰基的衍生化，常用的衍生化試劑為酸酐和鹵代酸酐，如乙酸酐、苯甲酸酐、乙酰氯、三氟乙酸酐等。咪唑類在衍生化過程中不產(chǎn)生酸，對(duì)促進(jìn)反應(yīng)和產(chǎn)物的穩(wěn)定性有利。一般在吡啶中，室溫下進(jìn)行。酯化或烷基化：用于羧酸和其他酸性基團(tuán)的衍生