蛋白質(zhì)與酶工程 第三章 酶的分離純化2016

Chapter3

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的提取與分離純化Contentsofchapter31、酶的提取與分離純化技術(shù)路線2、細胞破碎3、酶的提取4、酶的分離方法GoGoGoGo5、酶的組合分離純化策略Go6、酶的濃縮、干燥與結(jié)晶Go細胞結(jié)構(gòu)與酶分布酶的提取、分離純化酶的提取、分離純化是將酶從細胞或培養(yǎng)基中取出，再與雜質(zhì)分開，而獲得與使用目的、要求相適應的有一定純度的酶產(chǎn)品的過程

基本原則一、防止變性失效二、可以采用比一般蛋白質(zhì)分離更多更有效的方法和條件三、提取、純化的每一步都應進行酶活力的檢測3.1酶的提取、分離純化技術(shù)路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。注意點1.除了少數(shù)例外，所有操作都應在低溫下條件下進行，尤其在有有機溶劑存在時更應特別小心2.大多數(shù)酶在pH<4或pH>10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個系統(tǒng)不要過酸或過堿；同時要避免在調(diào)節(jié)pH時產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。3.酶和其它蛋白質(zhì)一樣，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應盡量減少泡沫形成。4.重金屬、有機溶劑等能使酶變性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應予以足夠的重視。3.2細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理本章目錄超聲波破碎法利用超聲波的機械振動而使細胞膜上所受張力不均而破碎。Fig.Sonicator酶的提取是指在一定的條件下，用適當?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。3.3酶的提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。本章目錄影響提取的主要因素１溫度

溫度對酶的提取效果影響明顯，適當提高溫度，可以增加酶的溶解度和分子擴散速度，但溫度過高會引起酶的變性失活。采用有機溶劑時，溫度控制在０~１０℃低溫條件下。室溫下提取的有酵母醇脫氫酶，細菌堿性磷酸酶，胃蛋白酶。因此在不影響酶的活性條件下，適當提高溫度，有利于酶的提取。２ＰＨ

溶液的ＰＨ對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響，不同的ＰＨ酶會帶不同的電荷及其帶的電荷量不同，酶在等電點的溶解度最低，故提高溶解度應該避開等電點，但不能過高過低。３提取液的體積

增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。過量的提取液會使酶濃度降低，對分離純化不利。所以提取液總量一般為原料體積的３~５體積，最好分幾次提取。在酶的提取過程中，體積小，顆粒的比表面積大，擴散面積大，有利于提高擴散速度，適當?shù)臄嚢韬瓦m當?shù)难娱L時間，可使酶更好的溶解出來。注意為了保護酶的穩(wěn)定性，可加某些保護劑，如與酶作用的底物，輔酶，某些抗氧化劑。分離方法的選擇為了獲得理想的分離效果應注意：工作前應對所要純化的酶的理化性質(zhì)(溶解度、分子大小和解離特性)以及酶的穩(wěn)定性等有一個較全面的了解。判斷選擇的方法與條件是否適當，始終應以活力測定為準則。要嚴格控制操作條件，防止變性。3.4酶的分離酶的分離純化方法現(xiàn)有的酶的分離純化方法都是根據(jù)酶和雜蛋白在下列性質(zhì)上的差異建立的。性質(zhì)方法分子大小離心，超離心法、凝膠過濾，膜分離技術(shù)（超濾，反滲透，微孔過濾，透析，電滲析等）溶解度鹽析法，有機溶劑沉淀法，共沉淀法，選擇性沉淀法，結(jié)晶電荷或基團離子交換色譜，電泳，等電聚焦，吸附色譜，疏水色譜，聚焦色譜穩(wěn)定性選擇性變性法（熱，酸堿，表面活性劑）特殊（專一性結(jié)合）親和色譜，親和洗脫，親和電泳

酶的分離方法1、沉淀分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go本章目錄1、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理

鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離復合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離鹽析沉淀法鹽析法是最古老的，但也是目前仍廣泛采用的方法。鹽析法根據(jù)的原理是：球蛋白在低鹽濃度的溶液中，溶解度隨鹽離子強度升高而增大，表現(xiàn)“鹽溶(saltingin)”的特性。但是當鹽濃度繼續(xù)升高，并超過某一上限時，其溶解度又會先后以不同速度下降，分別“鹽析(saltingout)沉淀析出。鹽析純化法就是根據(jù)酶和雜蛋白在高鹽濃度的溶液中溶解度差別差別而建立的一種純化方法。球蛋白溶解度-溶液離子強度關(guān)系鹽析中性鹽類使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀的原因：1).中和蛋白質(zhì)分子表面電荷2).與蛋白質(zhì)顆粒競爭水分子不同蛋白質(zhì)表面極性基團、帶電數(shù)目及分布等不同，因而可以分級沉淀。鹽析法應控制pH使接近等純化酶的等電點。蛋白質(zhì)濃度在1mg/ml以上，低溫。此法優(yōu)點：簡便，安全，重現(xiàn)性好缺點：分辨率低，純度提高不顯著，同時為了下一步純化，有時還需要脫鹽。鹽析鹽析法的一個發(fā)展就是和色譜技術(shù)相結(jié)合形成鹽析色譜法(saltingoutchromatography)，即以瓊脂糖等非極性物質(zhì)為柱色譜的支持體，在高濃度條件下將樣品中的蛋白質(zhì)鹽析吸附，然后再梯度地降低鹽類濃度，使酶和雜蛋白分別洗脫出來。這種技術(shù)的優(yōu)點是純化量大，重復性好，分辨率高較。鹽析蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度，與溶液中的離子強度有關(guān)：Log(S/S0)=-KsILogS=LogS0-KsI=-KsIS蛋白質(zhì)或酶在離子強度為I時的溶解度（w/v)S0蛋白質(zhì)或酶在離子強度為0時的溶解度

Ks鹽析常數(shù)

I離子強度鹽析在一定的溫度和pH條件下（為常數(shù)），通過改變離子強度的方法可使不同的蛋白質(zhì)或酶分離，稱為KS分段鹽析。在一定的鹽和離子強度條件下（Ks、I為常數(shù)），通過改變溫度或pH值使不同物質(zhì)分離，稱分段鹽析。鹽析蛋白質(zhì)鹽析沉淀中，常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、和磷酸鈉等，硫酸銨最常用。不同的酶，鹽析時所需的鹽濃度個不相同。酶的來源、酶的濃度、雜質(zhì)的成分等對鹽析時所需的鹽濃度也有所影響。經(jīng)鹽析后的酶沉淀，含有大量鹽分，需采用透析、超濾或?qū)游龅确椒ㄟM行脫鹽。等電點沉淀法原理：利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低和不同的電解質(zhì)具有不同的等電點的特性，通過調(diào)節(jié)溶液的PH，使酶或蛋白質(zhì)沉淀析出，從而使酶和蛋白質(zhì)分離的方法。等電點時，兩性電解質(zhì)分子的靜電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來。由于在等電點時，兩性電解質(zhì)表面的水化膜依然存在，故實際上酶等大分子蛋白質(zhì)仍有一定的溶解性，從而使沉淀不完全。在實際中，此法經(jīng)常與其他方法一起使用，如等電點經(jīng)常與鹽析沉淀，有機溶劑沉淀，和復合沉淀一起使用。單獨使用時，主要是從粗酶中除去某些等電點相差較大的蛋白質(zhì)。加酸堿時，一邊攪拌一邊慢慢加進，防止局部過酸過堿一起蛋白質(zhì)變性。等電點沉淀法如：純化動物材料抽提液中的酶時，可將pH先調(diào)整至5左右，待放置片刻后，核蛋白等顆粒雜質(zhì)就會沉淀析出，使酶溶液達到“一步澄清”。又如：純化血清膽堿脂酶時，可先將pH先調(diào)至2.8~3.0，除去酸性雜蛋白。有機溶劑沉淀法有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)分子間的靜電引力，導致蛋白質(zhì)的溶解度下降；也可與水作用使蛋白質(zhì)脫水而趨于凝集、沉淀。利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中溶解度差異而分離的方法稱有機溶劑沉淀法。應考慮：溫度

pH離子和離子強度有機溶劑此法優(yōu)點：分辨率高，溶劑易除去。缺點：溫度控制不當時易引起變性。本節(jié)目錄有機溶劑沉淀法用于蛋白質(zhì)純化的有機溶劑中，丙酮的分離效果最好，引起失效的情況比較少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有機溶劑濃度通常以百分體積表示，加入量可按下式計算：V=Vo*(S2-S1)/(S-S2)V－應加入的有機溶劑體積

Vo－原溶液的體積S2－所要達到的有機溶劑百分濃度S1－原溶液中有機溶劑的百分濃度S－待加有機溶劑的百分濃度

復合沉淀法定義：在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復合物沉淀下來，從而使酶和雜質(zhì)分離的方法稱為復合沉淀法。常用的復合沉淀劑：單寧，聚乙二醇，聚丙烯酸例：菠蘿蛋白酶與單寧復合可以制成藥片，用于治療咽喉炎復合物有的可以直接中使用，有的用適當?shù)姆椒ǎ姑笍膹秃衔镏形龀鲞M一步純化。復合沉淀法利用離子型表面活性劑如SDS、非離子型表面活性劑如聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）、聚乙烯亞胺以及單寧酸、硫酸鏈霉素等，在一定條件下能與蛋白質(zhì)直接地形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)沉淀析出，然后再用適當方法使需要的酶溶解出來，除去雜蛋白和沉淀劑，從而達到純化的目的。復合沉淀法以聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)純化限制性內(nèi)切核酸酶RE.EcoRI為例。在該酶生產(chǎn)菌株的超聲破碎離心上清液中，包含大量的DNA和雜蛋白。PEI在0.2mol/LKCl的條件下，能和DNA以及與之相關(guān)的蛋白質(zhì)一起凝聚沉淀析出；但當KCl的濃度上升至0.6mol/L時，雖然PEI與DNA及雜蛋白仍處于沉淀狀態(tài)，而RE.EcoRI卻能重新溶解，因此可將酶和雜蛋白分離開來，使RE.EcoRI得到初步純化。選擇性變性沉淀法定義：選擇一定的條件使雜蛋白變性沉淀，而不影響所需酶的方法。方法：熱處理，改變PH或加入某些金屬離子應用此法必須對與分離的酶以及酶液中的雜蛋白的種類含量及其物理和化學性質(zhì)有較全面的了解。本節(jié)目錄2、離心分離

離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。常速離心機又稱為低速離心機,其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等固形物的分離。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。高速離心機的最大轉(zhuǎn)速為（1～2.5）×104r/min，相對離心力達到1×104～1×105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細胞碎片和細胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活,有些高速離心機裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機。超速離心機的最大轉(zhuǎn)速達(2.5～12)×104r/min，相對離心力可以高達5×105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。實驗室離心機溫度類型：常溫及冷凍超速離心機均為冷凍型。使用冷凍離心機時提前降溫，預冷離心頭，開蓋關(guān)機。使用超速離心機時先抽真空。離心的形式

角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。角式離心機和離心頭（轉(zhuǎn)子）

角式離心頭要配套，低溫使用要預冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。水平轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)時隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）時。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，離心機的大?。号_式離心機的大小：落地式離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋離心機操作

平衡、定溫、定速、定時。離心機其它類型

超速冷凍離心機

立式螺旋過濾離心機活塞推料離心機

碟片式離心機外形管式離心機三足離心機J-30I高速冷凍離心機實例1：用途1.細菌，蛋白沉淀-核酸提取-細胞/亞細胞組份分離。2.動、植物病毒分離、血液血清提取及溶液中大、小顆粒不同組份的分離。、操作步驟1、打開離心機蓋,選擇容量適合的轉(zhuǎn)子，將帶樣品離心管放入轉(zhuǎn)子內(nèi)（樣品一定要平衡好），再將轉(zhuǎn)子放入離心室內(nèi)固定好轉(zhuǎn)子。2、關(guān)好離心機蓋，設(shè)定離心機轉(zhuǎn)子型號、轉(zhuǎn)速、離心時間、溫度、啟動運轉(zhuǎn)。3、離心時間到待轉(zhuǎn)速降至零，打開離心機蓋將樣品（離心管）取出，離心結(jié)束。方法差速離心；采用不同的離心速度和離心時間，分離大小和密度相差較大的顆粒。沉降速度離心（區(qū)帶離心，密度梯度離心）：樣品在平緩的介質(zhì)梯度中移動，最小密度大于介質(zhì)的最大密度，不同物質(zhì)按沉降速度的大小形成區(qū)帶。介質(zhì)為蔗糖、甘油。分離密度相近大小不同的樣品，如蛋白。沉降平衡離心（等密度梯度）：介質(zhì)的梯度有適當陡度，最大密度大于樣品的最大密度，樣品各組分移動到與各自密度相同的位置。介質(zhì)為CsCl。常用于分離大小相近密度不同的樣品，如核酸。2．1密度梯度離心

密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)不同的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的梯度介質(zhì)制成的。梯度介質(zhì)應有足夠大的溶解度，以形成所需的密度，不與分離組分反應，而且不會引起分離組分的凝聚、變性或失活。常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)，其梯度范圍是：蔗糖濃度5％～60％，密度1.02～1.30g/cm3。密度梯度的制備可采用梯度混合器，也可將不同濃度的蔗糖溶液，小心地一層層加入離心管中，越靠管底，濃度越高，形成階梯梯度。離心前，把樣品小心地鋪放在預先制備好的密度梯度溶液的表面。離心后，不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。各區(qū)帶內(nèi)的顆粒較均一，分離效果較好。在密度梯度離心過程中，區(qū)帶的位置和寬度隨離心時間的不同而改變。隨離心時間的加長，區(qū)帶會因顆粒擴散而越來越寬。為此，適當增大離心力而縮短離心時間，可以減少區(qū)帶擴寬。

2．2等密度離心

將CsCl2、CsSO4等介質(zhì)溶液與樣品溶液混合，然后在選定的離心力作用下，經(jīng)足夠時間的離心，銫鹽在離心場中沉降形成密度梯度樣品中不同浮力密度的顆粒在各自的等密度點位置上形成區(qū)帶。常用來分離提取核酸、亞細胞器和質(zhì)粒。前述密度梯度離心法中，欲分離的顆粒未達到其等密度位置，故分離效果不如等密度離心法好。應當注意的是，銫鹽濃度過高和離心力過大時，銫鹽會沉淀管底，嚴重時會造成事故，故等密度梯度離心需由專業(yè)人員經(jīng)嚴格計算確定銫鹽濃度和離心機轉(zhuǎn)速及離心時間。此外，銫鹽對鋁合金轉(zhuǎn)子有很強的腐蝕性，故最好使用鈦合金轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)子使用后要仔細清洗并干燥。蔗糖密度梯度離心CsCl等密度梯度離心離心條件的確定離心力離心時間溫度和pH值離心力低速離心一般用轉(zhuǎn)速，即轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如5000r/min.而在高速特別是超速離心時，往往以相對離心力（RCF）表示，如5000g.相對離心力是顆粒所受到的離心力與地心的引力的比值。式中，RCF為相對離心力（g);FC為離心力；Fg為地心引力;n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（r/min);r為旋轉(zhuǎn)半徑（cm).顆粒距離離心軸越遠，其所受的離心力越大。一般離心力的數(shù)值是平均數(shù)值，即在離心溶液中點處顆粒所受的離心力。

離心時間對于低速和高速離心機和差速離心來說，離心時間是指顆粒從離心管樣品液的液面完全沉降到離心官底的時間，稱為沉降時間或澄清時間。對于密度梯度離心而言，離心時間是指形成界限分明的區(qū)帶時間，稱為區(qū)帶形成時間。等密度梯度離心，是指顆粒完全達到等密度點的平衡時間，稱為平衡時間。其中最常用的是沉降時間。沉降時間沉降時間決定于顆粒的沉降速度和沉降距離。

t表示沉降時間（s);s表示顆粒的沉降系數(shù);w表示轉(zhuǎn)子的角速度（rad/s);r1,，r2分別表示旋轉(zhuǎn)軸中心到樣品液液面和離心管底的距離(cm)上式子做如下變換

k稱為轉(zhuǎn)子因子溫度和PH離心溫度一般控制在4℃左右，對于某些耐熱性較好的酶，也可以在室溫下進行離心分離。但在超速離心和高速離心時，由于轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會發(fā)熱而引起溫度升高，必須采用冷凍裝置，使溫度維持在一定范圍內(nèi)。離心介質(zhì)的PH必須處于酶穩(wěn)定的PH范圍內(nèi)，必要時可采用緩沖溶液，過高過低可能引起酶的變性失活，還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機其他部件的腐蝕，應當加以注意。膜過濾技術(shù)（membranefiltration）：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)。

膜分離技術(shù)已被國際上公認為20世紀末至21世紀中期最有發(fā)展前途，甚至會導致一次工業(yè)革命的重大生產(chǎn)技術(shù)，所以可以稱為前沿技術(shù)，是世界各國研究的熱點。廣泛應用于生物工程、化學、制藥、飲料、電力、冶金、海水淡化、資源再生等領(lǐng)域。滲出液3、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。膜分離技術(shù)的地位和影響美國官方文件曾說“18世紀電器改變了整個工業(yè)進程，而20世紀膜技術(shù)將改變整個面貌”，“目前沒有一種技術(shù)，能像膜技術(shù)這么廣泛地被應用”日本和歐洲則把膜技術(shù)作為21世紀的基盤技術(shù)進行研究和開發(fā)?！罢l掌握了膜技術(shù)，誰就掌握了化學工業(yè)的未來”-NormanN.Li，美國科學院院士，著名華裔科學家。膜分離已得到廣泛應用。21世紀是工業(yè)生物技術(shù)的世紀，膜技術(shù)將扮演重要角色。過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)根據(jù)過濾介質(zhì)的不同非膜過濾定義：采用高分子膜以外的材料，如濾紙，濾布，多孔陶瓷，纖維，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱為非膜過濾，包括粗濾和部分微濾粗濾：借助于過濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于2μm的顆粒，使固形物和液體分離的技術(shù)。粗濾應用范圍：酵母霉菌動植物細胞培養(yǎng)基殘渣大顆粒固形物粗濾介質(zhì)：濾紙濾布纖維多孔陶瓷燒結(jié)金屬助濾劑：硅藻土活性炭紙粕推動力：常壓過濾加壓過濾減壓過濾粗濾常壓過濾以液位差為推動力的過濾方法過濾設(shè)備簡單，操作易行方便，但過濾速度慢分離效果差加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為推動力的過濾方法。設(shè)備簡單，過濾較快，過濾效果好減壓過濾又稱真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質(zhì)的下方抽真空，增加過濾介質(zhì)上下方之間的壓力差，推動液體通過過濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過濾方法。

微濾定義：又稱微孔過濾。微濾所截留的顆粒直徑在0.2~2μm。無菌水，汽水等飲料的生產(chǎn)中廣泛應用。一般采用微孔陶瓷，燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)，也可用微濾膜。

借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆粒或分子進行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。膜分離加壓膜分離微濾超濾反滲透電場膜分離電滲析離子交換膜電滲析擴散膜分離透析膜分離技術(shù)

加壓膜分離加壓膜分離定義：以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力的膜分離技術(shù)。分類(以截留顆粒大?。?/p>

1微濾

2超濾

3反滲透（一）微濾(MF)又稱微孔過濾，是以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。（1）截留顆粒直徑：0.2~2um。（2）操作壓力：低于0.1MPa。（3）應用：實驗室和生產(chǎn)中通常利用微濾技術(shù)除去或收集酶發(fā)酵液中的細胞。無菌水、礦泉水、純生啤酒的生產(chǎn)。熱敏性藥物和營養(yǎng)物質(zhì)的過濾除菌等.細胞水鹽大分子小分子（二）超濾(UF)可截留溶液中溶解的大分子物質(zhì)，而透過小分子物質(zhì)。（1）截留顆粒直徑：2~200nm。（2）操作壓力：0.1~0.7MPa。（3）應用：一是分離純化，從高分子物質(zhì)與低分子物質(zhì)的溶液中，使低分子物質(zhì)透過膜；二是溶液的濃縮。大分子水鹽小分子（三）反滲透(RO)在壓力作用下，溶劑（通常是水）透過膜，而溶質(zhì)被阻擋于膜壁外。（1）截留顆粒直徑：小于2nm。（2）操作壓力：0.7~13MPa。（3）應用：主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。在酶液的濃縮、無離子水的制備、海水淡化等方面廣泛應用。溶質(zhì)水水膜溶質(zhì)水水膜滲透反滲透水鹽小分子大分子反滲透（RO）電場膜分離定義：電場膜分離是在半透膜兩側(cè)分別裝上正負極，在電場的作用下，帶電的小分子或者離子向與它們所帶電荷相反的方向移動，透過半透膜達到分離的目的。電滲析電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽，海水淡化，純水制備以及其他帶電荷小分子的分離。用于凝膠電泳后含有的蛋白質(zhì)或核酸的凝膠帶電荷大分子的分離。離子交換膜點滲析與電滲析一樣，只是用離子交換膜代替半透膜。電滲析在電場作用下，帶電離子透過膜向兩極移動，而達到分離的目的。酶液膜膜+-+-應用：電滲析主要用于酶液或其他溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備等

擴散膜分離定義：利用小分子的擴散作用，不斷使小分子透過半透膜擴散到膜外，而大分子被截留，從而達到分離的效果。材料動物膜羊皮紙火棉膠賽璐玢透析袋酶溶液蒸餾水應用：在生物分離方面，主要用于生物大分子溶液的脫鹽。由于透析過程以濃差為傳質(zhì)推動力，膜的透過通量很小，不適于大規(guī)模生物分離過程，而在實驗室中應用較多。

透析鹽類水膜透析水膜滲透透析血液透析膜分離技術(shù)的基本流程滲出液膜組件料液罐濃縮液（回流液）泵中空纖維超濾器中空纖維膜分離裝置是將成束的中空纖維裝入一筒內(nèi)，兩端封閉。當軸流通過管腔時，造成高剪切力，在截留溶質(zhì)分子的同時，將濃度降至最低限度。每根中空纖維內(nèi)腔直徑為0.2mm,中空纖維由惰性的非離子聚合物制成．具有各向異性、抗堵塞性，運用成束纖維表面積大，流量大、阻留溶質(zhì)的濃度范圍(4％一20％左右)如右圖。生產(chǎn)中常用的膜分離裝置中空纖維超濾膜組件清洗液清洗液出口滲出液滲出液（c）膜的結(jié)構(gòu)膜表層：孔徑各異，厚度為0.1~5um基層：起支持作用，厚度為50~250um4、層析分離層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個相中，其中一個相為固定的(稱為固定相)，另一個相則流過此固定相(稱為流動相)并使各組分以不同速度移動，從而達到分離。層析分離方法

層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。紙上層析分配薄層層析分配氣相層析離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。按活性基團的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進行酶的分離純化。凝膠層析又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。常用的凝膠：

葡聚糖凝膠

瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

親和層析是利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物,酶與競爭性抑制劑,酶與輔助因子,抗原與抗體，酶RNA與互補的RNA分子或片段,RNA與互補的DNA分子或片段等之間，都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應用.親和層析的四個要素常用的親和介質(zhì)及專一性配體根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：

共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

疏水層析與反相層析的基本原理本節(jié)目錄4、電泳分離帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極移動的過程稱為電泳。根據(jù)各種蛋白質(zhì)解離、電學性質(zhì)上的差異，利用它們在電場中的遷移方向與遷移速度不同而進行純化的一類方法。電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：

紙電泳薄層電泳薄膜電泳凝膠電泳自由電泳等電聚焦電泳

顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的凈電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強度、溶液pH值、離子強度及支持體的特性等外界條件的影響。紙電泳紙電泳是以紙為支持物的電泳技術(shù)。操作過程：1：支持物的選擇，一般采用層析濾紙為支持物。2：選擇一定的PH和一定強度的緩沖液3：點樣,量要適當4：電泳實驗時先將一厚濾紙條在一定的pH緩沖液中浸泡，取出后兩端加上電極，在濾紙中央滴少量待測溶液。電泳速度不同的各組分即以不同速度沿紙條運動。經(jīng)一段時間后，在紙條上形成距起點不同距離的區(qū)帶。區(qū)帶數(shù)等于樣品中的組分數(shù)。將紙條干燥并加熱，將各蛋白質(zhì)組分固定在紙條上，再用適當方法，進行分析。

薄層電泳薄層電泳:是將支持體與緩沖液調(diào)制成適當厚度的薄層而進行的電泳技術(shù)。支持體：淀粉纖維素硅膠瓊脂淀粉最為常用，淀粉板薄層電泳廣泛應用于蛋白質(zhì)，核酸和酶的分離。薄膜電泳

薄膜電泳：醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持體的電泳技術(shù)。薄膜電泳的分辨力雖然比不上紙電泳和薄層電泳，但此法具有簡單，快速，區(qū)帶清晰，靈敏度高，易于定量和便于保存的特點，廣泛應用于各種酶的分離。

凝膠電泳凝膠電泳是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。獨特之處：具有電泳和分子篩的雙重作用。支持體：聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂凝膠應用：主要用于酶分子質(zhì)量的測定，酶蛋白和酶RNA的順序測定以及酶的分離檢測等電點聚焦凝膠利用各組分等電點的不同而進行分離的電泳技術(shù)，簡稱為等電點聚焦或者電聚焦。等電點聚焦凝膠在酶和其他蛋白質(zhì)的分離中廣泛應用。優(yōu)點：1分辨率高，可將等電點相差0.01~0.02PH單位的蛋白質(zhì)分開。2隨著時間的延長，區(qū)帶越來越窄，而其他電泳由于擴散作用越來越寬。3樣品混合液加在電泳的任何部位，經(jīng)過電泳，由于電聚焦的作用，各組分都可以聚焦到各自等電點PH的位置。4濃度很低的樣品都可以分離，而且重現(xiàn)好

5可以很準確地測定酶和其他蛋白質(zhì)，多肽等兩性電解質(zhì)的等電點。缺點：

1電泳過程要求使用無鹽溶液，有些酶和蛋白質(zhì)在無鹽溶液的溶解度較低。

2電泳后各組分都聚焦到各自的等電點，對某些在等電點時溶解度低或可能變性的組分不適用。

聚焦電泳的操作過程1pH梯度支持介質(zhì)的制備2電泳3分離組分的檢測5、萃取分離萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時也可采用其它流體。按照兩相的組成不同，萃取可以分為：

有機溶劑萃取 雙水相萃取 超臨界萃取 反膠束萃取

有機溶劑萃取利用物質(zhì)在水和有機溶劑的溶解度不同而分離。由于有機溶劑容易引起酶和蛋白質(zhì)的失活變性，酶在萃取過程中，在低溫下進行，減少酶和有機溶劑的接觸時間。操作過程

1選取合適的有機溶劑，考慮酶的溶解度和有機溶劑對酶穩(wěn)定性的影響。

2將欲分離組分和預冷的有機溶劑結(jié)合

3將有機相和水相分開

4加熱或抽真空盡快使組分和有機溶劑分開。雙水相萃取利用物質(zhì)在互不相容的水相中溶解度不同而分離的方法。雙水相一般有互不相容的兩高分子水相或者鹽溶液和高分子水相組成。如聚乙醇溶液和葡萄糖溶液。雙水相系統(tǒng)的形成(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)

由于兩種高分子聚合物之間存在相互排斥作用（不相容性），一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當達到平衡時，即形成分別富含不同聚合物的兩相。除雙聚合物系統(tǒng)外，聚合物與無機鹽的混合溶液也可形成雙水相。PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)各種雙水相系統(tǒng)聚合物P

聚合物Q或鹽聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羥丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纖維素羥甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羥乙基纖維素葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸鎂，硫酸銨，硫酸鈉，甲酸鈉，酒石酸鉀鈉雙水相萃取由于兩相都是水溶液，可以避免酶的失活變性。雙水相系統(tǒng)中水的含量高，分離后的酶濃度低，需經(jīng)過濃縮等以提高產(chǎn)量，；雙水相系統(tǒng)中含有高分子聚合物或鹽類，在分離后需要進一步進行分離純化，以除去高分子聚合物和鹽類等雜質(zhì)。雙水相分離細胞碎片和酶的流程：雙水相法分離酶的過程示意圖1－細胞懸浮液；2－細胞破碎機；3－萃取器；4－PEG；5－無機鹽；6－離心機；7－含目標產(chǎn)物的上清液；8－含細胞碎片的下相超臨界萃取超臨界萃取又稱超臨界流體萃取，使利用物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體的溶解度不同而分離的技術(shù)。超臨界萃取裝置中藥材分離工程什么是超臨界流體

超臨界流體（SCF）是指物質(zhì)的壓力和溫度同時超過其臨界壓力(Pc)和臨界溫度(Tc)時的流體。即，T>Tc，P>Pc分離工程超臨界流體不是液體，也不是通常狀態(tài)下的氣體，是一種特定狀態(tài)的流體1、處于臨界點狀態(tài)的物質(zhì)可實現(xiàn)從液態(tài)到氣態(tài)的連續(xù)過渡，兩相界面消失，汽化熱為零。2、超過臨界點的物質(zhì)（T>Tc

），不論壓力有多大，都不會使其液化，壓力的變化只引起流體密度的變化。超臨界流體的性質(zhì)（1）密度接近于液體，這使它具有與液體溶劑相當?shù)妮腿∧芰?。?）黏度和擴散系數(shù)與氣體相近似，而溶劑的低黏度和高擴散系數(shù)的性質(zhì)是有利于傳質(zhì)的，具有很高的傳質(zhì)速度。（3）該流體隨著溫度與壓力的連續(xù)變化，對物質(zhì)的萃取具有選擇性。氣體、超臨界流體和液體性質(zhì)的比較性質(zhì)相態(tài)氣體超臨界流體液體密度/g·cm-310-30.71.0黏度/cP10-3~10-210-210-1擴散系數(shù)/cm2·S-110-110-310-5超臨界流體是指在31.1℃和13.78MPa時的CO2。超臨界流體萃取（Supercriticalfluidextraction，SFE）超臨界流體萃取技術(shù)（SFE）是利用超臨界流體（SCF）作為萃取劑，從液體或固體中萃取出特定成分，以達到某種分離目的的技術(shù)。CO2由于具有合適的臨界條件，對健康無害，不燃燒，不腐蝕，價格便宜和易于處理等優(yōu)點，是最常用的超臨界萃取劑。超臨界流體萃取流程萃取階段:在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體與原料接觸進行萃取獲得萃取相。分離階段：使萃取組分與超臨界流體分離。萃取階段分離階段分離工程由上表中可見：大部分碳氫化合物其臨界壓力在5MPa左右；對低碳烴化物，如乙烯、乙烷等，其臨界溫度近常溫，而環(huán)狀的脂肪烴和芳香烴具有較高的臨界溫度；水和氨具有較高的臨界溫度和壓力，這是因為極性大和氫鍵的緣故；二氧化碳具有溫和的臨界溫度和相對較低的臨界壓力，為最常用的超臨界流體；對于臨界溫度在0～100℃范圍的流體，適用于提取天然植物有效成分。超臨界流體萃取的應用醫(yī)藥工業(yè)化學工業(yè)食品工業(yè)化妝品香料中草藥提取酶，纖維素精制金屬離子萃取烴類分離共沸物分離高分子化合物分離植物油脂萃取酒花萃取植物色素提取天然香料萃取化妝品原料提取精制根據(jù)分離方法不同分為：

1等壓分離

2等溫分離

3吸附分離

改變壓力的超臨界萃取流程原料萃取相溶劑萃取產(chǎn)物萃余相萃取器分離器減壓閥壓縮機P1T1T2P2等溫法T1＝T2，P1＞P2（1）等溫變壓流程改變溫度的超臨界萃取流程等壓法T1<T2，P1=P2加熱器原料萃取相溶劑萃取產(chǎn)物萃余相萃取器分離器閥門泵冷卻器T1T2P1P2（2）等壓變溫流程采用吸附分離的超臨界萃取流程閥門原料萃取相溶劑吸附劑萃余相萃取器吸附器泵（3）等溫等壓吸附流程吸附法T1=T2，P1=P2反膠束萃取定義：利用反膠束將酶或蛋白質(zhì)從混合溶液萃取出來的一種分離純化技術(shù)。反膠束又稱反膠團，是表面活性劑分散于連續(xù)有機相中形成的納米尺度的一種集體。反膠束是透明的，熱力學穩(wěn)定的系統(tǒng)。膠束和反膠束結(jié)構(gòu)示意圖

酶的分離純化

層析技術(shù)引言層析法的發(fā)現(xiàn)與進化歷史

思想層析法的基本原理根據(jù)引言內(nèi)容,是否可以總結(jié)概括出層析法的基本原理？引言1850年德國科學家朗格首先發(fā)現(xiàn)了色譜分離的現(xiàn)象，當他把一種有顏色的物質(zhì)滴到一張濾紙上，觀察到它們擴散成一圈圈的圓環(huán)。探索與發(fā)現(xiàn)11906年俄國植物學家茨維特（MichaelTswett）:將碳酸鈣細粉裝入玻璃瓶，石油醚抽提葉子的色素溶液傾入，接著倒入石油醚洗滌，柱上部出現(xiàn)了綠色的葉綠素，中間是黃色的葉黃素，而在下面則是胡蘿卜素橙黃色他在論文中寫到：“（原文）一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結(jié)果按照不同色素的吸附順序在管內(nèi)觀察到它們相應的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖?！碧剿髋c發(fā)現(xiàn)2概念:固定相,流動相,色譜柱現(xiàn)代色譜柱Whichiswhich?1905-1930.1931年德國庫恩(Kuhn)重復了茨維特實驗,用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,和γ-胡蘿卜素，此后用這種方法分離了60多種這類色素，1938年他從維生素

B

中分離出

B

6.1938年的諾貝爾化學獎。探索與發(fā)現(xiàn)3WhynotTswett?相同時期發(fā)生在中國大地的事件1894年：中日甲午戰(zhàn)爭,侵占臺灣。1897年：德國侵占膠州灣。1900年：八國聯(lián)軍侵略中國。1914年：占領(lǐng)青島,奪取膠州灣。1931年：九一八事變,占領(lǐng)東北,建立滿州國。1937年：盧溝橋事變。1941年生物化學家Martin（馬?。┖蚐ynge（辛格）把色譜法應用于氨基酸的分離。將淀粉作為色柱里的填料:淀粉色譜法濾紙作為載體:紙色譜法覆蓋了吸附劑表面的并與流動相不發(fā)生混溶的固定液來代替以前的固體吸附劑:Liquid-liquid(partition)Chromatography,LLC).提出色譜塔板理論;預測氣相色譜;提出用細小顆粒作填料,而兩端可以加壓(HPLC).1952年：馬丁，辛格對分配層析的研究和發(fā)現(xiàn)，諾貝爾化學獎羊毛中的氨基酸分離探索與發(fā)現(xiàn)4塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內(nèi)不同組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡分配系數(shù),partitioncoefficient:是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。例:將MgCl2溶解于辛醇和水的混合液體,分別測量MgCl2在辛醇和水中的濃度,計算比值.好溶解的分配系數(shù)小,不好溶解的分配系數(shù)大.1952年，馬丁同詹姆斯(James)，把LLC技術(shù)原理應用在分離氣體上。各種氣體或蒸汽的混合物利用氮或氦一類情性載氣的氣流通過吸收性固體的表面?；旌系臍怏w通過后,在另一端出現(xiàn)時就分開了。氣相色譜的產(chǎn)生(GC)探索與發(fā)現(xiàn)5高效液相色譜(HPLC)的應用20世紀60年代以來,氣相色譜作為分析方法已經(jīng)不能滿足對生物成分分析測試的要求。高效液相色譜采用了壓力泵及填有很細的顆粒高效色譜柱。HighPerformanceLiquidChromatography.探索與發(fā)現(xiàn)6液相色譜與氣相色譜法比較

氣相液相對象氣體,沸點低液相,沸點高固定相固體,固體涂層液固體,固液流動相惰性氣體,起運載作用液體，與組分可產(chǎn)生親和力環(huán)境高溫常溫應用化工分析，環(huán)境生物分子，蛋白核酸，醫(yī)藥層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理、化學性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異使各組分在兩相（固定相和流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。

物理、化學性質(zhì)（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等）

（1）按流動相狀態(tài)分類：液相色譜液-固層析液-液層析氣相色譜氣-固層析氣-液層析層析法的分類兩種固定相：(固定相不一定是固體)*固體吸附劑作為固定相*吸附在固體上的液體（硅膠吸附的水作固定相，以氯仿作流動相，分離羊毛中的氨基酸）（2）按層析原理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能

的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)（或溶解度）不同。離子交換層析:利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。（3）按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，類似紙層析。層析分離方法

層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離吸附層析技術(shù)吸附柱層析薄層層析聚酰胺薄膜層析疏水層析√√吸附層析:利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、價格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

吸附柱層析吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱狀的一種層析方法。1.固定相：是由層析基質(zhì)組成的。其基質(zhì)包括固體物質(zhì)（如吸附劑、離子交換劑）和液體物質(zhì)（如固定在纖維素或硅膠上的溶液），這些物質(zhì)能與相關(guān)的化合物進行可逆的吸附、溶解和交換作用。2.流動相：在層析過程中推動固定相上的物質(zhì)向一定方向移動的液體或氣體稱為流動相。在柱層析時，流動相又稱洗脫液或洗滌劑。在薄層層析時流動相又稱展層劑。吸附劑常用的吸附劑有羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石和活性炭等。

活性炭(Silicagel)：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭，最好選用顆?；钭⑻?，若為活性炭細粉，則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱，以免流速太慢?；钚蕴恐饕糜诜蛛x水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙?；钚蕴康奈阶饔?，在水溶液中最強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力最弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加?；钚蕴繉Ψ枷阕寤衔锏奈搅Υ笥谥咀寤衔?，對大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開，單糖與多糖分開，氨基酸與多肽分開。吸附原理:

吸附劑與被吸附物質(zhì)之間的吸引力是范德華力，作用可逆吸附層析的應用氨基酸、肽、糖類、脂類、苷（皂苷）類物質(zhì)的分離、鑒定純凈水、醫(yī)藥用水的制備藥液脫色吸附柱層析洗脫體積（Ve）：是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度達到最大值時的流動相體積。薄層層析(TLC)

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。薄層層析可根據(jù)固定相的種類分為吸附薄層層析（吸附劑為固定相）、分配薄層層析（固定在支持劑上的水溶液或有機溶劑為固定相）和離子交換薄層層析（離子交換劑為固定相）等。薄層層析薄層層析的優(yōu)點：1.展層時間短，薄層層析分離混合物一般僅需15-60min；2.設(shè)備簡單，操作方便，既適用于分析，也適用于制備；3.靈敏度高。薄層層析紙色譜法（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）吸附TLC固定相是硅膠，氧化鋁等，層析是依據(jù)吸附力不同第三章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)分配層析技術(shù)分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。分配系數(shù)：當一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在流動相和固定相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)。K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中的分配的數(shù)量多，移動慢；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動快。因此可彼此分開。hH（分配TLC，纖維結(jié)構(gòu)，固定相是纖維-水）紙色譜法第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)凝膠過濾層析技術(shù)一、基本原理

概念：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，因分子大小不同而分離。又名分子篩層析。原理：凝膠顆粒為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?；旌衔锪鬟^時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。吸收

洗脫體積ml凝膠固定相與流動相：凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，流動相是流動的洗脫液。排阻極限：指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。排阻極限為30000表示30000Da的分子將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。3.凝膠顆粒大小

常以目數(shù)(mesh)或者顆粒直徑(mm)來表示。分辨率和流速都與凝膠顆粒大小有關(guān)。顆粒大，流速快，但分離效果差；顆粒小，分離效果較好，但流速慢。100目~0.250毫米。二、常用概念三、凝膠的種類和性質(zhì)

1.交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)

1)SephadexG(SephadexG-25；SephadexG-50)G后的數(shù)字為凝膠吸水率（單位是ml/g干膠）的10倍。

2）SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)。

交聯(lián)葡聚糖凝膠是由葡聚糖和甘油基通過醚橋交聯(lián)而成的。

2.瓊脂糖凝膠（Sepharose；Bio-Gel)

依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。

3.Superdex

是由高交聯(lián)度多孔瓊脂糖與葡聚糖共價結(jié)合而成的。分辨率非常高，化學物理穩(wěn)定性也很好。

4.聚丙烯酰胺凝膠一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠-P（Bio-GelP)。凝膠技術(shù)參數(shù)指標凝膠型號：如SephadexG-10;G-25;粒度范圍：100-200mesh床體積（ml/g）:每克干膠溶漲后的體積有效分離范圍：如1x1031x107工作pH:4-12最大流速：1ml/min最大承受壓力:2MPa三、凝膠的選擇和保存

1.凝膠的選擇

例如樣品中各個組分差別較大，則可以選用大顆粒的凝膠，這樣可以很快的達到分離的目的；如果有個別組分差別較小，則要考慮使用小顆粒凝膠以提高分辨率。2.凝膠的保存

凝膠的保存一般是反復洗滌去除蛋白等雜質(zhì)，然后加入適當?shù)目咕鷦?，通常加?.02％的疊氮化鈉,或20%酒精,4C下保存。

四、

凝膠過濾在試驗室中的應用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測定3）脫鹽及去除小分子雜質(zhì)4）溶液濃縮5）去熱源物質(zhì)LogMABCLogM測Ve蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，LogM=（k1-k2）Ve

（Ve為洗脫體積）先測得幾種標準蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)一、原理:離子交換層析是利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對各種離子的親和力不同而達到分離目的的一種層析分離方法。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團和平衡離子。

離子交換層析法纖維素—O—CH2—

COO-—Na+圖纖維素陽離子交換劑組成示意圖離子交換層析的基本原理示意圖++++———++++++++++—+++二、離子交換基質(zhì)的分類及常見種類：（一）分類陽離子交換劑：磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2

）、

羧酸（-COOH）、酚羥基（-OH）等

陰離子交換劑：伯胺（-NH2OH）、仲胺（-NHCH3OH）、

叔胺（-N（CH3）2OH）、季胺（-N（CH3）3OH）等

（二）種類

1）樹脂型離子交換劑

2）纖維素離子交換劑

3）交聯(lián)葡聚糖離子交換劑

4）瓊脂糖離子交換劑三、離子交換劑的再生與保存

離子交換劑可在柱上再生也可室內(nèi)瓶裝保存。如離子交換纖維素可用2mol/LNaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％洗必泰，陽離子交換劑可用0.02％疊氮鈉。四、離子交換層析的實驗室應用除去離子（純凈水）聚苯乙烯樹脂廣泛的應用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面

分離純化改變成分（青霉素-Na＋——青霉素-K＋）濃縮與提?。股亍⒌鞍踪|(zhì)、工業(yè)廢液中微量金屬的提取）離子型化合物分離發(fā)展：自動化方向與光譜技術(shù)結(jié)合－專門用途的綜合性自動分析儀與計算機相連－進行自動分析與自動控制第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）原理：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，而使生物分子分離純化的技術(shù)。如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體等。親和層析包括三個共價結(jié)合的組分：不溶性的基質(zhì)（matrix）、一個間隔臂（spacer）及特異的配基（ligands）親和層析法目前親和層析技術(shù)主要運用在實驗室中親和層析的四個要素FractionandmonitoringVolumeofeluentAbsorbanceFractions123456789Anactualexampleforgel-filtrationSDSanalysis第四章層析技術(shù)第一節(jié)吸附層析技術(shù)第二節(jié)分配層析技術(shù)第三節(jié)凝膠過濾層析技術(shù)第四節(jié)離子交換層析法第五節(jié)親和層析法第六節(jié)高壓液相層析（HPLC)高壓液相層析（HPLC）特點：①使用的固相支持劑顆粒很細，表面積很大,因而分辨率很高.（顆粒細，理論塔板數(shù)多）②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。（顆粒硬度大、流速快，耐高壓）③重復性好④色譜柱可以反復使用⑤自動化操作，分析精確度高許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。分類

正相色譜法：

共價結(jié)合到載體上的基團都是極性的基團，流動相的極性比固定相的極性弱。在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度，先從柱中流出來。

反相色譜法

共價結(jié)合到載體上的集團是一些直鏈碳氫化合物，流動相的極性比固定相的極性強。在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度而先從柱中流出。快快一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機分子（有機酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。

實踐中，一種物質(zhì)如蛋白的分離純化往往不是單一實驗技術(shù)能夠達到的。3.5酶的組合分離純化策略Resolution（分辨率）Speed（速度）Capacity（容量）Recovery（回收率）設(shè)計分離純化工藝的基本要求本章目錄3.6酶的濃縮、干燥與結(jié)晶濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶的分離純化過程中是一