課題2-土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)2

課題2土壤中分解尿素的細菌的分離和計數(shù)1專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用三.實驗的具體操作

㈠.土壤取樣

從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3厘米左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。2為什么？◆取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。什么方法？（二）制備培養(yǎng)基

準備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

3什么原則？將稀釋相同倍數(shù)的菌液，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。問題：為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結(jié)論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。4◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度稀釋倍數(shù)目的細菌104、105、106保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板放線菌103、104、105真菌102、103、104原因：不同微生物在土壤中含量不同◆應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g?！粼谙♂屚寥廊芤旱倪^程中，每一步都要在火焰旁進行◆分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30～300之間、適于計數(shù)的平板（三） 樣品的稀釋6

由于初次實驗，對于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。㈣.取樣涂布◆實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。7㈤.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：30～37℃培養(yǎng)1～2d放線菌：25～28℃培養(yǎng)5～7d霉菌：25～28℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。8◆如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30～300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。微生物的培養(yǎng)與觀察9[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間

四、操作提示10五.結(jié)果分析與評價1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30—300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。11六.課外延伸

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌能夠分解尿素。12大腸桿菌呈黑色中心,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征

13測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到伊紅美藍培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。14濾膜法測定細菌數(shù)目：本課題知識小結(jié):151.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（）

A.培養(yǎng)細菌

B.培養(yǎng)真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是()

A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素實踐訓練CD163.下列說法不正確的是（）

A.科學家從70－80度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶

B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值

C.設(shè)置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度

D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。4.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（）

A.較多的氮源物質(zhì)B.較多的碳源物質(zhì)

C.青霉素類藥物D.高濃度食鹽BC17用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目，其結(jié)果與實際值相比（）

A.比實際值高

B.比實際值低

C.和實際值一致

D.比實際值可能高也可能低B下列能選擇出分解尿素的細菌的培養(yǎng)基是()A.KH2PO4、NA2HPO4、MgSO4.7H2O、葡萄糖、尿素、瓊脂、水

B.KH2PO4