DNA合成誤差校正

ErrorcorrectioningenesynthesistechnologyTrendsinBiotechnologyMarch2012,Vol.30,No.3

基因的合成通常是用酶組裝通過化學(xué)方法合成的寡聚合甘酸，合成的結(jié)果不可避免的出現(xiàn)缺失、插入和堿基替換等情況，基因合成的保真度是確保基因正確表達的首要條件，在自然條件下，不管原核還是真核生物其合成基因的錯誤率一般在1/107左右，而我們?nèi)藶榈幕蚝铣善溴e誤率一般在1/102左右.本文介紹了一些基因合成過程中校正技術(shù)。1)合成寡核苷酸過程中的錯誤刪除。2)合成基因過程中的錯誤刪除。2.1)用MutS錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤。2.2)用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤。目錄亞磷酰胺法示意圖合成流程1）1）主要錯誤的形式：第一、亞磷酰胺單體沒能結(jié)合到延伸鏈上，導(dǎo)致出現(xiàn)缺失出現(xiàn)，出錯率在1.5%~0.5%左右。第二、尚未耦合的鏈被乙?；K止反應(yīng)，導(dǎo)致提前終止合成，出錯率在0.5%左右。第三、第二步合成過量的催化劑會導(dǎo)致DMT脫保護，然后再結(jié)合一份子亞磷酰胺而導(dǎo)致插入的出現(xiàn)，出錯率在0.4%左右.1）錯誤的排除方法用HPLC和PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）通過長度大小的不同對其進行純化。疏水的凈化筒可以對尚未脫去DMT保護基的Oligos進行純化，用這兩種方法可以除掉90%的雜質(zhì)（大部分是插入、刪除和切斷）。缺點是：人力勞動量太大，而且沒辦法除去堿基替換和單個堿基的插入或刪除。2)

盡管對Oligos經(jīng)過了繁瑣的純化還是有一部分錯誤會隨著Oligos進入下游的合成中，而且在聚合酶的延伸過程中也會引入一些新的錯誤，例如錯配等。選擇一個正確無誤的基因序列經(jīng)常要用到克隆測序的方法，此外表達分析和functionalscreens也經(jīng)常用于檢查基因的正確與否，但是這種方法只對蛋白的編碼區(qū)域有效，對其他不表的區(qū)域無效。2)對于長鏈DNA的合成一般是通過合成長度小于1kb的BB，測序正確之后再把BB連成長的基因.下面介紹一大類在基因合成過程中排除錯誤的方法：用MutS錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤；

用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤。作用機理如圖所示2)2.1）

MutS蛋白是一種細菌的MutHLS錯配修復(fù)器的一部分，它能夠識別并綁定各種錯配堿基。在變性和再次退火之后，錯誤包含在異源雙鏈核酸分子中，用MutS蛋白把含有錯誤的鏈給綁定，通過凝膠電泳來分離。這種方法經(jīng)一次處理能使錯誤減小到1/3.5kb，其缺陷是需要其自身大量雙聯(lián)是正確無誤的。對于錯誤多的可以采用以下方法，這種方法叫consensusshuffling,DNA經(jīng)過退火后，加入限制性內(nèi)切酶的混合物，然后加入到固載有MutS蛋白的筒形過濾器中，洗脫再做一個菌落PCR即可消除錯誤。MutS錯誤不協(xié)調(diào)綁定蛋白消除錯誤核酸內(nèi)切酶2.1）2.2）用不協(xié)調(diào)切斷酶校正錯誤

不協(xié)調(diào)切斷酶是說一類能夠在異源雙鏈核酸分子中識別和切斷錯配序列的限制性內(nèi)切酶，它可以分為三類：第一類是游離酶，例如：噬菌體T4內(nèi)切酶VII，T7內(nèi)切酶I，大腸桿菌核酸內(nèi)切酶V；第二類是錯配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH；第三類是單鏈特異性核酸酶，例如：S1核酸酶，P1核酸酶，綠豆核酸酶，CEL核酸酶。

游離酶的作用機制：

Thereannealedheteroduplexesarecleavedinbothstrandsbymismatch-specificenzymes2–5bpdownstreamofthemismatches,generatingstaggerendsthatareimmediatelydissociatedatthereactiontemperature.Thesingle-strandedoverhangsthatcontainmismatchbasesaredegradedbyanexonucleaseinthereactionmixture.Full-lengthgeneswithfewererrorsarerecoveredbyoverlapassemblyPCR錯配修復(fù)核酸內(nèi)切酶MutH大腸桿菌的MutH,MutL和MutS蛋白構(gòu)成的細菌錯配修復(fù)機制：首先是MutS檢出并綁定錯配堿基和single-strandloops，然后MutH和MutL一起作用于MutS綁定的突變體，在兩股鏈不匹配的地方產(chǎn)生切口，再通過解旋酶和外切酶的作用是錯配位點形成平末端。形成的缺口可以用聚合酶和連接酶補齊。單鏈特異性核酸酶單鏈特異性的核酸酶在一定程度上非常專一性的作用特定的錯誤為類型，例如：SI和P1核酸酶能夠更有效作用于富含AT的區(qū)域，S1不能夠識別單個不匹配的堿基，而綠豆核酸酶在pH6–6.5的條件下能夠切除一定量單個堿基的突變。CEL核酸內(nèi)切酶是第一個從真核生物中發(fā)現(xiàn)的核酸內(nèi)切酶，它能夠作用于各種類型的堿基的錯配和DNA的畸變。

CEL核酸內(nèi)切酶作用機制：錯配的堿基先通過CEL核酸內(nèi)切酶切開和再用PhusionDNApolymerase校正，這種方法非常適合于錯誤較多的合成序列。低質(zhì)量的合成序列經(jīng)過退火一般都會產(chǎn)生少量的無誤的雙鏈DNA，CEL核酸內(nèi)切酶在異源雙鏈核酸分子中緊挨著錯誤位點切開，PhusionDNApolymerase切掉錯誤的位點，最后無誤的DNA片段通過PCR組裝成全長的基因。steps:(i)reannealingofassembledgeneconstructstopresenterroneousbasesasmismatches;(ii)CELnucleasecleavageonbothstrandsatthe3`sideofthemismatches;(iii)exonucleasetrimmingofsingle-strandedmismatchoverhangsbyaddedexonucleaseorthe3-5exonucleaseactivityoftheproofreadingPCRenzyme;and(iv)reasse