轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器

關(guān)于轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器1第一頁，共七十一頁，2022年，8月28日2轉(zhuǎn)基因小鼠模型

歷史1974,Jaenisch等人,整合SV40基因的小鼠1980,Gordon等人,育成人胸苷激酶的轉(zhuǎn)基因小鼠1982,Palmiter等人,轉(zhuǎn)大鼠生長激素（GH）基因的小鼠

第二頁，共七十一頁，2022年，8月28日3轉(zhuǎn)GH基因超級小鼠第三頁，共七十一頁，2022年，8月28日4轉(zhuǎn)基因兔、牛、豬、羊、魚、小鼠……

第四頁，共七十一頁，2022年，8月28日5新加坡國立大學(xué)生物系轉(zhuǎn)基因斑馬魚1.熒光魚第五頁，共七十一頁，2022年，8月28日6第六頁，共七十一頁，2022年，8月28日7第七頁，共七十一頁，2022年，8月28日82.蜘蛛羊第八頁，共七十一頁，2022年，8月28日9研究者將高度活躍的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎?；蜣D(zhuǎn)化的老鼠在運(yùn)動時有效利用身體脂肪產(chǎn)生能量，同時避免產(chǎn)生大量乳酸。3.超級老鼠第九頁，共七十一頁，2022年，8月28日10不怕貓的老鼠。在科學(xué)家展示的照片中，一只褐色老鼠離一只貓不到一英寸，在貓的身邊嗅來嗅去。研究人員確認(rèn)并移除了老鼠大腦嗅球上的某些感受器，結(jié)果這些老鼠變成了一群無所畏懼的嚙齒動物，在天敵面前轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去，顯示出極強(qiáng)的好奇心，永遠(yuǎn)不知道危險的存在。

4.無所畏懼老鼠第十頁，共七十一頁，2022年，8月28日11

2003年7月11日由陳系古教授領(lǐng)導(dǎo)的“人類轉(zhuǎn)基因動物模型的制作”課題組歷時5年，研制成功了四種轉(zhuǎn)基因小鼠。其中，熒光鼠為胚胎干細(xì)胞、人類基因功能、人體組織工程和克隆器官等研究提供了基礎(chǔ)；患白化病的小鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)了酪氨酸酶基因后長出了黑毛；四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)和丙肝核心抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠分別傳到第四、第三代，為制備人類丙肝病毒感染的雙基因動物模型提供了父代、母代。第十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日12第十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日13第十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日14第十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日15轉(zhuǎn)基因動物模型優(yōu)勢：可以從整體水平、器官水平、組織水平、分子水平進(jìn)行多層次、全方位、深入而又系統(tǒng)的綜合研究。第十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日16

借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細(xì)胞的分裂而擴(kuò)增，在體內(nèi)表達(dá)并能穩(wěn)定的移轉(zhuǎn)給后代的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。一、轉(zhuǎn)基因動物（transgeneticanimal）第十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日17目的基因的來源采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；目的基因的克隆。第十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日18顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細(xì)胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法第十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日191.顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用顯微操作技術(shù)轉(zhuǎn)移外源基因的方法。此法轉(zhuǎn)入基因長度可達(dá)數(shù)百kb；并能隨機(jī)地整合在受體體細(xì)胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。第十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日20microinjection第二十頁，共七十一頁，2022年，8月28日第二十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日22受精卵顯微注射制備轉(zhuǎn)基因動物的缺點(diǎn)1.外源基因整合至基因組的效率很低，對經(jīng)濟(jì)大動物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.隨機(jī)整合，轉(zhuǎn)基因整合的位點(diǎn)和拷貝數(shù)無法控制，造成轉(zhuǎn)基因的表達(dá)差異很大，篩選高表達(dá)轉(zhuǎn)基因動物的工作量很大；3.對經(jīng)濟(jì)大動物，由于需要大量的供體和受體，耗時長、費(fèi)用昂貴，受到很大的限制。第二十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日23將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)以達(dá)到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法。

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法第二十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日24

優(yōu)點(diǎn)：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高第二十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日25缺點(diǎn)：容納大小有限(<10-15kb)

重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端容易甲基化，影響外源基因的表達(dá)潛在致癌性,載體復(fù)雜整合率不高,胚胎自我保護(hù)機(jī)制對其有抗性第二十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日263.胚胎干細(xì)胞方法第二十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日27

優(yōu)點(diǎn)：外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細(xì)胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達(dá)的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細(xì)胞的方法多樣，細(xì)胞鑒定及篩選方便。第二十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日28

缺點(diǎn)：

ES細(xì)胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細(xì)胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體第二十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日29目前，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動物上應(yīng)用較晚。第二十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日304.精子載體導(dǎo)入法第三十頁，共七十一頁，2022年，8月28日31

5酵母人工染色體載體法（YAC）利用酵母人工染色體(ＹＡＣ)作為載體制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。

酵母人工染色體（ＹＡＣ）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體,能克隆百萬對堿基的大片段ＤＮＡ。

第三十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日32

優(yōu)點(diǎn)：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率提高。

保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性,因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。

第三十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日336、體細(xì)胞核移植法

將外源基因?qū)氲襟w細(xì)胞中，再將該細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，用這種細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植（把體細(xì)胞核植入一個去了核的卵母細(xì)胞中，融合并激活），將重組胚進(jìn)行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管。第三十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日347.其它方法……性腺轉(zhuǎn)基因方法

第三十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日35

總結(jié)：轉(zhuǎn)基因動物的制作方法1、受精卵雄原核顯微注射法2、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4、精子載體法5、YAC法6、體細(xì)胞核移植法第三十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日36顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細(xì)胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法第三十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日37基因打靶利用細(xì)胞脫氧核糖核酸(DNA)可與外源性DNA同源序列發(fā)生同源重組的性質(zhì)，定向改造生物某一基因的技術(shù)。1、基因敲除（geneknockout）2、基因替換（geneknockin）第三十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日38基因敲除（geneknockout），指外源DNA與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細(xì)胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細(xì)胞的基因組中,而獲得的內(nèi)源目的基因缺失或功能喪失的轉(zhuǎn)基因動物。第三十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日39基因替換（geneknockin），指外源DNA與受體基因組中特定的內(nèi)源基因發(fā)生同源重組而相關(guān)的兩個內(nèi)源基因中的一個基因的編碼區(qū)被另一個基因的編碼區(qū)的拷貝所置換的基因動物。第三十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日40基因打靶基因敲除（geneknockout）將基因組特定內(nèi)源基因定點(diǎn)突變基因替換（geneknockin）將基因組特定內(nèi)源基因進(jìn)行定向重組第四十頁，共七十一頁，2022年，8月28日41顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細(xì)胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法第四十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日42三、轉(zhuǎn)基因動物的檢測第四十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日43DNA的提取PCR/RT-PCRSouthern雜交表達(dá)產(chǎn)物的檢測（蛋白/下游產(chǎn)物）第四十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日44

Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。Southern印跡雜交是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。第四十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日451、改良動物品種2、生物制藥3、動物模型4、異體器官移植5、基因治療四、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用第四十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日46轉(zhuǎn)基因動物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會問題五、轉(zhuǎn)基因動物研究存在的問題第四十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日47六、細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用方法第四十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日481.電穿孔法實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移利用脈沖電場提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。第四十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日492.磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)這種方法是受二價金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞菌吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當(dāng)核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細(xì)胞攝取DNA的能力顯著加強(qiáng)。磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細(xì)胞膜被細(xì)胞內(nèi)吞。不適用于原代細(xì)胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復(fù)性差,有些細(xì)胞不適用第四十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日503.脂質(zhì)載體法將需要轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞膜類似，因此可以與受體細(xì)胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。第五十頁，共七十一頁，2022年，8月28日51第五十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日524.病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA病毒）（2）腺病毒（雙鏈DNA病毒）第五十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日53第五十三頁，共七十一頁，2022年，8月28日54第五十四頁，共七十一頁，2022年，8月28日55第五十五頁，共七十一頁，2022年，8月28日56比利時藍(lán)牛第五十六頁，共七十一頁，2022年，8月28日57動物生物反應(yīng)器第五十七頁，共七十一頁，2022年，8月28日58

一般把目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器,動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。第五十八頁，共七十一頁，2022年，8月28日59一、動物血液生物反應(yīng)器

外源基因在血液中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物叫血液生物反應(yīng)器。大家畜的血液容量較大,利用動物血液生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進(jìn)展。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來,血細(xì)胞組分可通過裂解細(xì)胞獲得。第五十九頁，共七十一頁，2022年，8月28日60二、動物膀胱生物反應(yīng)器

外源基因在膀胱中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器,叫動物膀胱生物反應(yīng)器。膀胱尿乳頭頂端表面可表達(dá)一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達(dá)具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5′端調(diào)控序列中,就可以指導(dǎo)外源基因在尿中表達(dá)。第六十頁，共七十一頁，2022年，8月28日61三、動物乳腺生物反應(yīng)器

動物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動物乳腺特異性表達(dá)的啟動子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物,指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達(dá),并從轉(zhuǎn)基因動物的乳液中獲取重組蛋白。第六十一頁，共七十一頁，2022年，8月28日621.動物乳腺生物反應(yīng)器的制備（1）表達(dá)載體的構(gòu)建目前用于表達(dá)載體的啟動子調(diào)控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件，主要有四類乳腺定位表達(dá)調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調(diào)控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調(diào)控序列；第四類是乳清白蛋白基因調(diào)控序列。第六十二頁，共七十一頁，2022年，8月28日63（2）目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是，正常情況下濃度低、翻譯后修飾復(fù)雜、其它表達(dá)體系難以表達(dá)或表達(dá)量低、應(yīng)用前景廣闊的蛋白基因。第六十三頁