肺結(jié)核的新診斷技術課件

新診斷技術及其在NTP中的應用江蘇省結(jié)核病參比實驗室NTP中現(xiàn)行實驗室技術涂片：萋尼染色顯微鏡檢培養(yǎng)：固體培養(yǎng)基：簡單法、離心法藥敏：固體培養(yǎng)基：絕對濃度法、比例法菌種鑒定：鑒別培養(yǎng)基＋生化試驗傳統(tǒng)實驗室技術不能適應不斷深入的結(jié)核病防治工作的需要實驗室新診斷技術總覽細菌學檢測方法發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）液體培養(yǎng)分子生物學檢測方法GenexpertHAINGenechip免疫學檢測方法ELISOPT&TSPOT和Quantiferon血清學診斷方法BACTECTB460原理：標本經(jīng)前處理接種至含有14C-棕櫚酸的12B培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)。分枝桿菌分解14C-棕櫚酸，產(chǎn)生14CO2，BACTECTB460儀自動檢測，14CO2含量，并換算成生長指數(shù)（GI）。優(yōu)點：快速：將分離培養(yǎng)的陽性檢出時間由常規(guī)培養(yǎng)所需的2-8周縮短至3-14天，將藥敏試驗的報告時間由常規(guī)方法的4周縮短至1周。操作簡便、靈敏度高，可進一步做藥敏試驗、菌種初步鑒定。缺點：放射性同位素污染。儀器與試劑價格昂貴。未實現(xiàn)全自動化污染率高原理：是BACTECTB460的換代產(chǎn)品。標本經(jīng)前處理后接種到系統(tǒng)配套的液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中包被有對氧濃度敏感的熒光物質(zhì)，當細菌生長代謝消耗培養(yǎng)基中的氧時，氧濃度降低，熒光被激發(fā)，系統(tǒng)可以連續(xù)檢測熒光水平，自動報告結(jié)果。優(yōu)點：系統(tǒng)進一步優(yōu)化，操作更簡便、自動化更強。解決了BACTECTB460的同位素污染問題。24小時連續(xù)檢測，有利于早期報告陽性結(jié)果。缺點：儀器與試劑價格更昂貴。未能解決高污染率的問題BACTECMGIT960

分枝桿菌生長指示管液體培養(yǎng)1CrucianiM,etal.JCM2004;42:2321-23252

Meanof14studiesinMGIT960=10.7%(2.0-30.0)[]=acceptablerangeLED顯微鏡發(fā)光二級管(LED)技術提供價廉、穩(wěn)定的光源壽命150,000h反復開關不影響壽命不釋放有毒氣體不需要暗室操作人員工作負荷減輕快速藥敏-商業(yè)化線性探針檢測（LPAs）

GenoType?MTBDRplus,HAIN檢測結(jié)核分枝桿菌復合群以及利福平、異煙肼耐藥相關的突變檢測XDR的試劑盒也已經(jīng)發(fā)布INNO-LipaRifTB檢測結(jié)核分枝桿菌復合群以及于利福平耐藥相關的突變大多數(shù)利福平耐藥的菌株同時也耐異煙肼WHO鼓勵使用的工具可使用涂陽痰標本和培養(yǎng)物進行操作快速、簡便易用，僅需基本PCR技術然而，價格比較昂貴，且不能檢測造成耐藥突變的熱點區(qū)域外的突變11rpoB

野生型探針:WT1-WT8rpoB

突變探針:MUT1-3:D516V,H526Y,H526D,S531L→野生型缺失→野生型突變MTBDRplus

rpoB511513516518522526531533rpoBWT2rpoBWT4rpoBWT6rpoBWT8rpoBWT7rpoBMUT1(D516V)rpoBMUT3(S531L)rpoBMUT2A(H526Y)rpoBMUT2B(H526D)514515rpoBWT1rpoBWT3rpoBWT5509508505katG

基因突變MTBDRplus

katGMTBDRplus

inhAinhA

基因突變南非的經(jīng)驗：GenotypeMTBDRplusassay:直接從涂片陽性標本中檢測rpob基因突變(耐利福平),katG基因(高濃度異煙肼耐藥),inhA基因(低濃度異煙肼耐藥)靈敏度、特異度，陽性預測值、陰性預測值耐利福平98.9,99.4,97.9,和99.7耐異煙肼94.2,99.7,99.1,和97.9耐MDR-TB98.8,100,100,和99.7BarnardM,etal.AmJRespirCritCareMed2008;177:787-92結(jié)核耐藥檢測基因芯片激光共焦掃描儀軟件判讀結(jié)核耐藥檢測芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書樣品制備儀雜交儀通

量：兩個一線抗結(jié)核藥速

度：

6小時（比傳統(tǒng)藥敏試驗法快50-100倍）靈敏度：103CFU/反應特異性：對照設計嚴謹；自動判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥（利福平、異煙肼）。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2009（IF=2.3）18獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認證XpertMTB/RIF檢測結(jié)核分枝桿菌檢測利福平耐藥直接標本檢測100分鐘可獲得結(jié)果報告結(jié)果時間:1h45minGeneXpertDNA分子與PCR試劑混合樣本自動過濾和清洗超聲裂解捕獲的生物體，釋放DNA半嵌套實時PCR擴增

&檢測集成反應管456濃縮細菌去除抑制劑12標本液化和作用15分鐘后轉(zhuǎn)移2ml3結(jié)束手工工作7結(jié)果可打印XpertMTB/RIF單中心評估研究（初步結(jié)果）不同研究設計和研究人群，肺結(jié)核和肺外結(jié)核標本檢測結(jié)核匯總的未經(jīng)校正的敏感性

92%匯總的未經(jīng)校正的特異性

98%檢測利福平耐藥匯總的未經(jīng)校正的敏感性

98%匯總的未經(jīng)校正的特異性

99%操作方面廢棄物管理–如痰標本容器儲存和供應–反應盒龐大,2-28°C,有效期12個月

電力供應–UPS(400VA)或電池組

培訓–需求不高(使用計算機、預防污染)生物安全–與涂片鏡檢相同每年校正–模塊更換安全–防盜(計算機)WHO對XpertMTB/RIF的建議摘要：高度推薦用于懷疑MDR-TB以及合并HIV感染的結(jié)核病病人的初診診斷對于MDR－TB、HIV不嚴重的地區(qū)，可以在涂片之后考慮使用XpertMTB/RIF，特別是用于診斷涂陰病人（取決于費用）肺外標本的有關證據(jù)尚有限增加檢測次數(shù)可能增加敏感性，但需考慮費用增加適用于兒童不能替代傳統(tǒng)涂片、培養(yǎng)、藥敏試驗步驟

1:特異抗原激發(fā)淋巴細胞IFN-

釋放陰性對照ESAT-6或CFP-10孵育孵育顯影步驟

2:用ELISA檢測

IFN-

YYYYYYYYYYYY洗滌YYYYYY

洗滌YYYQuantiFERONTBGold?實驗T-SPOTTB(ELISPOT)技術

單核細胞分離TB抗原刺激，IFN-

釋放一抗捕獲IFN-

與標記的二抗結(jié)合

酶作用標記物－顯色每一斑點代表釋放IFN-的一個細胞YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYIFN-抗原國家結(jié)核病參比實驗室推薦建議液體培養(yǎng)用于:

結(jié)核病可疑癥狀者檢查,可以作為結(jié)核?。退帲┑脑\斷依據(jù)和結(jié)核病患者治療效果判斷,液體培養(yǎng)可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)培養(yǎng)推薦理由:液體培養(yǎng)在已經(jīng)在我國注冊；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和TAT優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)；數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；推薦使用層級:

區(qū)縣、地市和省級（醫(yī)療機構(gòu)和疾病預防機構(gòu)）國家結(jié)核病參比實驗室推薦建議GenXpert即將可以用于:

結(jié)核病可疑癥狀者檢查,可以作為結(jié)核病的輔助診斷方法和結(jié)核病患者治療效果判斷,它有望代替?zhèn)鹘y(tǒng)的培養(yǎng)和利福平的藥敏試驗（可疑耐藥結(jié)核病患者）推薦理由:即將在我國獲得注冊證書；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性，陽性結(jié)果報告時間優(yōu)于傳統(tǒng)方法；WHO在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

區(qū)縣（？）、地市和省級（醫(yī)療機構(gòu)和疾病預防機構(gòu)）國家結(jié)核病參比實驗室推薦建議LPA可以用于:

可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗推薦理由:在我國獲得注冊證書；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和特異性（TAT)較好；WHO在全球推薦數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

地市和省級（醫(yī)療機構(gòu)和疾病預防機構(gòu)）國家結(jié)核病參比實驗室推薦建議基因芯片可以用于:

可疑耐藥結(jié)核病患者查,它有望代替利福平和異煙肼的傳統(tǒng)藥敏試驗推薦理由:在我國獲得注冊證書；國內(nèi)研究顯示其敏感性和特異性和(TAT)較好；民族品牌數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性,符合成本效果；可能使用層級:

地市和省級（醫(yī)療機構(gòu)和疾病預防機構(gòu)）國家結(jié)核病參比實驗室推薦建議γ干擾素釋放試驗可以用于:

結(jié)核菌潛伏感染篩查,兒童和老年人以及免疫力低下者結(jié)核病的輔助診斷（參考）推薦理由:在我國獲得注冊證書，國家對一些特殊診斷試劑的規(guī)定；國內(nèi)外研究顯示其敏感性和（特異性）較好；數(shù)據(jù)顯示在我國具有可行性可能使用層級:

縣區(qū)、地市和省級（醫(yī)療機構(gòu)和疾