第三章紫外-可見分光光度分析法

第三章紫外-可見分光光度法顏色的產(chǎn)生白光(太陽光)：由各種單色光組成的復合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm遠紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）

有色物質的不同顏色是由于吸收了不同波長的光所致。溶液能選擇性地吸收某些波長的光，而讓其他波長的光透過，這時溶液呈現(xiàn)出透過光的顏色。透過光的顏色是溶液吸收光的互補色。

在光譜分析中，依據(jù)物質對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m，主要用于有機化合物結構鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結構鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質的定量分析。紫外—可見光分光光度法是利用某些物質的分子吸收200-800nm光譜區(qū)的輻射來進行分析測定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機和有機物質的定性和定量測定。

1、物質內部三種運動形式（1）電子相對于原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉動3.1基本原理3.1.1分子吸收光譜的形成分子三種不同能級：電子能級、振動能級和轉動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應的能量分子內能：電子能量Ee、振動能量Ev、轉動能量Er即E＝Ee+Ev+ErΔΕe>ΔΕv>ΔΕr2、能級躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。（1）電子能級的能量差ΔEe較大1～20eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜；（2）分子振動能級的能量差（能級間隔）ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；（3）轉動能級間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉動光譜（4）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內部能級分布狀況，是物質定性的依據(jù)。（5）物質對不同波長的光線具有不同的吸收能力，物質也只能選擇吸收那些能量相當于該分子能量（ΔΕe、ΔΕv、ΔΕr

）總和的輻射；（6）吸收譜帶強度與該物質分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。3．有機化合物的紫外—可見光譜

有機化合物的紫外—可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結果（三種）：σ電子、π電子、n電子。

分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。

外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：

n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

⑴σ→σ＊躍遷

所需能量最大，σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)(吸收波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λ為125nm,乙烷λmax為135nm⑵n→σ＊躍遷

所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λ分別為173nm、183nm和227nm。⑶π→π＊躍遷

所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)。孤立的π→π*躍遷一般在200nm左右，但具有共軛雙鍵的化合物，隨著共軛體系的延長，π→π＊躍遷的吸收帶將明顯向長波長方向移動，吸收強度也隨之增強。如乙烯的λ為162nm。⑷n→π＊躍遷

需能量最低，吸收波長λ>200nm。一般發(fā)生在近紫外區(qū)，吸收強度弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊

躍遷。丙酮n→π＊躍遷的λ為275nm.4.常用術語（1）生色團：

最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產(chǎn)生的、能在紫外可見光范圍內產(chǎn)生吸收的集團。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—。（2）助色團：

有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。（3）紅移與藍移λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。（4）增色效應和減色效應由于化合物結構改變或其他原因，使吸收強度（摩爾吸光系數(shù)ε）增強，稱增色效應；使吸收強度減弱，稱為減色效應。有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變溶劑使最大吸收波長λmax和吸收強度發(fā)生變化:3.1.2光吸收基本定律一、透射比和吸光度

當一束平行的單色光照射均勻的有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面反射。如果入射光的強度為I0，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，反射光的強度為Ir則:I0＝Ia＋It＋Ir

在吸光光度法中，由于采用同樣質料的比色皿進行測量，反射光的強度基本上相同，其影響可以相互抵消，上式可簡化為:I0＝Ia＋It

透過光的強度It與入射光的強度Io之比稱為透光度或透光率，用T表示。

T＝It/Io溶液的透射比越大，表示它對光的吸收越?。环粗?，透射比越小，表示它對光的吸收越大。常用吸光度來表示物質對光的吸收程度，吸光度A與透光度T的關系:A＝lg1/T=－lgT=lgIo/It二、朗伯—比耳定律1、朗伯定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關系。當用適當波長的單色光照射一固定濃度的溶液時，其吸光度與光透過的液層厚度呈正比，此即朗伯定律，其數(shù)學表達式為：A=k′lk′為比例系數(shù)，l為液層厚度（即樣品的光程長度）

朗伯定律適用于任何非散射的均勻介質，但它不能闡明吸光度與溶液濃度的關系。例1.有一單色光通過厚度為1cm的有色溶液,其強度減弱20%。若通過5cm厚度的相同溶液,其強度減弱百分之幾?解：lgT1

l1

─────=───lgT25l1

lgT2=5lgT1=5×lg0.80=-0.485T2=32.7%,即減弱67.3%

2、比耳定律1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關系。當用一適當波長的單色光照射厚度一定的均勻溶液時，吸光度與溶液濃度呈正比，即：A=k″c式中：c為溶液濃度，k″為比例系數(shù)。例2.一符合比爾定律的有色溶液，當濃度為c時，透射比為T，若其它條件不變，濃度為c/3時，T為_________，濃度為2c時，T為__________。

解:T1/3T2這說明濃度與透射比T

的是指數(shù)關系。

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數(shù)，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關系為：

a=ε/M（M為摩爾質量）3、朗伯—比耳定律透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關系:

A＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎和定量測定的依據(jù)。應用于各種光度法的吸收測量；

摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。4、摩爾吸光系數(shù)ε的特征

（1）吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；

（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；

（3）同一吸收物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質可能達到的最大靈敏度。

（4）可作為定性鑒定的參數(shù)；（5）εmax越大表明該物質的吸光能力越強，用光度法測定該物質的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104：高靈敏；

ε<2×104

：不靈敏。（6）ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。三、偏離朗伯—比耳定律的原因標準曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標準曲線常發(fā)生彎曲（尤其當溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學性因素，與樣品溶液有關。（1）物理性因素——難以獲得真正的純單色光

朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復合光可導致對朗伯—比耳定律的正或負偏離。

為克服非單色光引起的偏離，首先應選擇比較好的單色器。此外還應將入射波長選定在待測物質的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。(2)化學性因素

朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。①朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。②試液中各組分之間的相互作用。③試劑對吸收光譜的影響。④試樣為膠體、乳狀液或有懸浮物質時的影響。

6.2紫外-可見分光光度計可見分光光度計紫外-可見分光光度計一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。

2、單色器

將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。光柵和棱鏡分光原理3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結果顯示記錄系統(tǒng)數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結果處理。二、分光光度計的類型1.單光束經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光度的測定。適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描。2.雙光束雙光束分光光度計經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。3.雙波長雙波長分光光度計是由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值。對于多組分混合物、渾濁試樣分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。6.3顯色與測量條件的選擇

一、顯色反應的選擇1.顯色反應在無機分析中，很少利用金屬離子本身的顏色進行光度分析，因為它們的吸光系數(shù)值都比較小。一般都要選用適當?shù)脑噭?，與待測離子反應生成對紫外或可見光有較大吸收的物質再進行測定。這種反應稱為顯色反應，所用的試劑稱為顯色劑。

①反應的生成物必須在紫外，可見光區(qū)有較強的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大，反應有較高的選擇性；②反應生成物應當組成恒定、穩(wěn)定性好，顯色條件易于控制等，這樣才能保證測量結果有良好的重現(xiàn)性；③顯色劑在測定波長處無明顯吸收，顯色劑與有色配合物的最大吸收波長之差（對比度），要求△>60nm。2.選擇顯色反應時，應考慮的因素某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強烈吸收，可利用氧化還原反應對待測離子進行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋+10SO42-＋16H+將Mn2＋

氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進行測定3.氧化還原顯色反應4.顯色劑

無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。

有機顯色劑：種類繁多偶氮類顯色劑：本身是有色物質，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質穩(wěn)定、顯色反應靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量CR的關系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.顯色時間與溫度