檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法

中國(guó)專(zhuān)利獎(jiǎng)推薦項(xiàng)目介紹（發(fā)明/實(shí)用新型）專(zhuān)利號(hào)：ZL201410005008.7專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法申報(bào)單位：推薦單位：二〇二〇年九月十八日國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局制

一、申報(bào)項(xiàng)目基本信息專(zhuān)利號(hào)ZL201410005008.7專(zhuān)利名稱(chēng)檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法專(zhuān)利權(quán)人王昭發(fā)明人王昭；張嘉；王旖旎；王晶石；吳林IPC主分類(lèi)號(hào)IPC主分類(lèi)號(hào)可通過(guò)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站查詢。G01N21/64通訊地址/郵編聯(lián)系人1王昭手公電子郵箱zhaowww263@聯(lián)系人2手機(jī)辦公電話電子郵箱推薦單位

二、專(zhuān)利質(zhì)量評(píng)價(jià)材料評(píng)價(jià)“三性”和“文本質(zhì)量”,說(shuō)明參評(píng)專(zhuān)利質(zhì)量的優(yōu)秀程度（一）新穎性和創(chuàng)造性：列出若干個(gè)申請(qǐng)日之前最接近的技術(shù)，簡(jiǎn)要介紹其技術(shù)方案；并詳細(xì)說(shuō)明未對(duì)參評(píng)專(zhuān)利的新穎性和創(chuàng)造性構(gòu)成實(shí)質(zhì)性影響。NK細(xì)胞活性是判定機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一。51Cr釋放法被認(rèn)為是NK細(xì)胞活性測(cè)定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但此方法檢測(cè)成本高，且具有放射性污染，不宜普遍開(kāi)展。而LDH釋放法雖然操作簡(jiǎn)便，但易受時(shí)間和溫度的影響，穩(wěn)定性差，且要求受檢單個(gè)核細(xì)胞的數(shù)量較多，造成采血量增加以及嚴(yán)重血細(xì)胞減低的患者檢測(cè)失敗。流式細(xì)胞術(shù)作為一種新型的NK細(xì)胞活性測(cè)定方法，近年來(lái)得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。但目前各種流式測(cè)定方法存在檢測(cè)結(jié)果易受非特異性染色、熒光易丟失等因素影響。雖然前期公開(kāi)存在各類(lèi)NK細(xì)胞活性的檢測(cè)方法，但由于各種檢測(cè)方法均存在自身缺陷不足及操作條件的限制，仍缺乏一種可廣泛應(yīng)用及臨床推廣的可靠穩(wěn)定的NK細(xì)胞活性的檢測(cè)手段。因此，臨床上對(duì)于某些危重疾病的早期診斷仍面臨很大挑戰(zhàn)。那么，建立一種穩(wěn)定、準(zhǔn)確、直接、操作易行性強(qiáng)的檢測(cè)NK細(xì)胞活性的方法日漸凸顯其迫切性，是本領(lǐng)域技術(shù)人員一直存在并亟待解決的技術(shù)難題?；谏鲜鰡?wèn)題，為克服上述前期NK細(xì)胞活性檢測(cè)方法的不足，本專(zhuān)利研發(fā)建立了轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞活性技術(shù)，采用穩(wěn)定表達(dá)EGFP的長(zhǎng)期傳代靶細(xì)胞株，并采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記不同狀態(tài)靶細(xì)胞所占比例，并能直觀精準(zhǔn)的反映NK細(xì)胞的殺傷活性，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和成功率，并且宜于臨床推廣應(yīng)用。主要新穎性及創(chuàng)造性如下：1.本專(zhuān)利技術(shù)創(chuàng)新采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞株，使其能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染相比，克服了細(xì)胞長(zhǎng)期傳代后EGFP大量丟失的情況，保證了該檢測(cè)方法的長(zhǎng)期穩(wěn)定性；同時(shí)省去了預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞染色或抗體標(biāo)記的冗繁過(guò)程，也避免了非特異性染色以及標(biāo)記效/靶細(xì)胞所造成的細(xì)胞功能影響，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及檢測(cè)效率。2.采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡，具有特異性細(xì)胞染色功能，能夠計(jì)算出靶細(xì)胞各階段不同狀態(tài)(活細(xì)胞、早凋、晚凋及壞死細(xì)胞)所占比例，與單純使用核酸染料碘化丙啶(PI)染色僅能標(biāo)記死亡細(xì)胞相比較，能夠更全面、直觀、精準(zhǔn)地反映NK細(xì)胞殺傷活性。3.將流式細(xì)胞術(shù)與EGFP熒光細(xì)胞株相結(jié)合用于NK細(xì)胞活性檢測(cè)，該創(chuàng)新克服了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的放射性污染(51Cr釋放法)以及粗略性(LDH釋放法)的局限，敏感性及再現(xiàn)性強(qiáng)，并且對(duì)受檢者抽血量明顯減少，降低白細(xì)胞缺乏患者檢測(cè)失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性。該技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)如下：①檢測(cè)方法靈敏度提高：在判定原發(fā)性HLH的效能方面，采用該項(xiàng)技術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞活性的研究數(shù)據(jù)表明，ROC曲線下面積(AUC)為0.872，Youdenindex最大時(shí)對(duì)應(yīng)的敏感度為84.21%，特異度80.67%。②需采血量少：當(dāng)檢測(cè)血液中NK細(xì)胞的活性時(shí)，所需的血量大大減少，并且經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測(cè)方法用于檢測(cè)血液中NK細(xì)胞的活性時(shí)，抽血量為傳統(tǒng)技術(shù)(51Cr釋放法、LDH釋放法、MTT比色法)的25%。③本技術(shù)不需要放射性物質(zhì)，因此不存在放射性污染。④檢測(cè)時(shí)間短。本技術(shù)的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)僅為2-4h，大幅度節(jié)省了人力和物力資源的投入。綜上所述，本技術(shù)創(chuàng)新具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、樣品所需量小、無(wú)放射污染、檢測(cè)效率高等諸多優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)創(chuàng)新圖示如下：①熒光顯微鏡下觀察EGFP-K562細(xì)胞的凋亡情況，活細(xì)胞僅發(fā)出單一綠色熒光，凋亡細(xì)胞可被膜熒光染料AnnexinV-PE著色同時(shí)發(fā)出黃色熒光，細(xì)胞膜完整性被破壞的晚期凋亡及壞死細(xì)胞可被核酸染料7AAD著色發(fā)出紅色熒光。早期凋亡EGFP-K562細(xì)胞（低倍10×10）晚期凋亡及壞死EGFP-K562細(xì)胞（高倍10×40）②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性結(jié)果示意圖單純EGFP-K562細(xì)胞自然凋亡背景正常人NK細(xì)胞的殺傷活性HLH患者NK細(xì)胞的殺傷活性（二）實(shí)用性：結(jié)合實(shí)施情況，說(shuō)明參評(píng)專(zhuān)利的技術(shù)方案能夠制造或使用，并已產(chǎn)生了積極的效果。1.該專(zhuān)利技術(shù)成果被第30屆國(guó)際組織細(xì)胞學(xué)會(huì)議(30thHS,2014)選為大會(huì)發(fā)言《THESIGNIFICANCEOFANEWMETHODOFNKCELLACTIVITYBYFLOWCYTOMETRYINTHEDIAGNOSISOFADULTHEMOPHAGOCYTICSYNDROME》進(jìn)行匯報(bào)交流。研究成果相關(guān)論文《Applicationofanimprovedflowcytometry-basedNKcellactivityassayinadulthemophagocyticlymphohistiocytosis》于2017年發(fā)表在\o"Internationaljournalofhematology."IntJHematol.期刊雜志2017;105(6):828-834，系列相關(guān)研究論文分別發(fā)表在2019年ClinImmunol.期刊和2020年OrphanetJRareDis.期刊。2.該專(zhuān)利檢測(cè)技術(shù)被納入《HLH診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》中作為推薦檢測(cè)方法“關(guān)于NK細(xì)胞活性的檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定，推薦使用熒光細(xì)胞構(gòu)建與流式細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合的手段檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性方法?！薄浴妒裳?xì)胞綜合征診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》(噬血細(xì)胞綜合征中國(guó)專(zhuān)家聯(lián)盟,中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組.噬血細(xì)胞綜合征診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志.2018,98(2):91-9)3.該項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)作為噬血細(xì)胞綜合征(HLH)快速診斷中的一項(xiàng)重要技術(shù)，榮獲2017年度北京市科學(xué)技術(shù)三等獎(jiǎng)(2017醫(yī)-3-009-04)，2018年度華夏醫(yī)學(xué)科技獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)(編號(hào)：201802039U0201)，2019年度北京醫(yī)學(xué)科技獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)（編號(hào)：201902004）和2020年度“金橋獎(jiǎng)”二等獎(jiǎng)。4.目前已成功舉辦五屆“全國(guó)HLH相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)培訓(xùn)班”，推廣轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞活性技術(shù)，來(lái)自全國(guó)20多個(gè)省近500名實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員參加培訓(xùn)。該項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)在全國(guó)多家三甲醫(yī)院開(kāi)展了技術(shù)推廣及應(yīng)用，并出具應(yīng)用證明。5.該項(xiàng)發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)成果連同其相關(guān)專(zhuān)利技術(shù)目前已成功實(shí)現(xiàn)科技成果轉(zhuǎn)化簽約。6.以該項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)為依托，獲得科研項(xiàng)目如下：①首都衛(wèi)生科研發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(自主創(chuàng)新轉(zhuǎn)化項(xiàng)目2016)：轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞株聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定NK細(xì)胞活性的新技術(shù)及其臨床應(yīng)用；②北京市醫(yī)管局“揚(yáng)帆”計(jì)劃（臨床技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目2018）：NK細(xì)胞功能性檢測(cè)用于快速診斷噬血細(xì)胞綜合征的臨床研究。7.該項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)及相關(guān)內(nèi)容被多家網(wǎng)絡(luò)及視頻媒體(搜狐網(wǎng)、丁香園、華醫(yī)網(wǎng)等)進(jìn)行報(bào)道：①搜狐網(wǎng)：北京友誼醫(yī)院血液科領(lǐng)銜的科研項(xiàng)目獲北京市科學(xué)技術(shù)獎(jiǎng)勵(lì)三等獎(jiǎng)/a/222160295_100443，；②丁香園：專(zhuān)家訪談|北京友誼醫(yī)院王昭主任談噬血細(xì)胞綜合征-丁香園/article/582271；③華醫(yī)網(wǎng)：/cme/contents/30/21048.html；④搜狐網(wǎng)：/a/274951466_685811。三、技術(shù)先進(jìn)性評(píng)價(jià)材料（一）技術(shù)原創(chuàng)性及重要性：結(jié)合技術(shù)要點(diǎn)，說(shuō)明參評(píng)專(zhuān)利屬于基礎(chǔ)型的專(zhuān)利或改進(jìn)型專(zhuān)利，并解釋是否解決了本領(lǐng)域關(guān)鍵性、共性的技術(shù)難題。本發(fā)明專(zhuān)利基于流式細(xì)胞術(shù)、穩(wěn)定傳代熒光標(biāo)記細(xì)胞、特異性染色技術(shù)，實(shí)現(xiàn)NK細(xì)胞活性的實(shí)時(shí)精準(zhǔn)檢測(cè)，以克服目前檢測(cè)技術(shù)的局限性。1.目前流式細(xì)胞術(shù)多采用基因轉(zhuǎn)染方法使靶細(xì)胞特異性表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，這種瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)存在多次傳代后EGFP大量丟失的情況，因而影響檢測(cè)結(jié)果，難以保證實(shí)驗(yàn)的長(zhǎng)期性。本專(zhuān)利在研發(fā)過(guò)程中，構(gòu)建了攜帶綠色熒光蛋白(EGFP)目的基因的慢病毒質(zhì)粒載體并包裝形成慢病毒，然后用上述慢病毒侵染K562細(xì)胞，將目的基因整合到靶細(xì)胞的基因組中，并篩選得到一株穩(wěn)定表達(dá)EGFP的單克隆K562細(xì)胞系，使其能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。解決了靶細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的技術(shù)難點(diǎn)，保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性，并易于保存和轉(zhuǎn)運(yùn)。2.目前用于凋亡細(xì)胞標(biāo)記的染色劑PI僅能標(biāo)記晚期凋亡及壞死細(xì)胞，故無(wú)法反映NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞殺傷的早期凋亡。本專(zhuān)利采用AnnexinV-PE/7AAD雙染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡，能夠計(jì)算出靶細(xì)胞各階段不同狀態(tài)(活細(xì)胞、早凋、晚凋及壞死細(xì)胞)所占比例，將那些處于早期凋亡階段(傳統(tǒng)方法無(wú)法體現(xiàn))的細(xì)胞明確標(biāo)記，可以更全面、直觀、精準(zhǔn)的反映NK細(xì)胞的殺傷活性。因此解決了現(xiàn)有檢測(cè)手段難以對(duì)NK細(xì)胞實(shí)際殺傷能力進(jìn)行評(píng)估的技術(shù)難點(diǎn)。3.該創(chuàng)新克服了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的放射性污染(51Cr釋放法)以及粗略性(LDH釋放法)的局限，敏感性及再現(xiàn)性強(qiáng)，并且對(duì)受檢者抽血量明顯減少，降低白細(xì)胞缺乏患者檢測(cè)失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性。（二）技術(shù)優(yōu)勢(shì)：１．對(duì)比若干個(gè)當(dāng)前（參加評(píng)獎(jiǎng)時(shí)）的同類(lèi)技術(shù)，詳細(xì)說(shuō)明參評(píng)專(zhuān)利在提高效率、降低成本、節(jié)能減排、改善性能、提升品質(zhì)等方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和不足。２．結(jié)合實(shí)施情況，相對(duì)于公開(kāi)的技術(shù)方案，說(shuō)明參評(píng)專(zhuān)利技術(shù)實(shí)施效果的確定性。該專(zhuān)利檢測(cè)技術(shù)與目前各類(lèi)技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染使靶細(xì)胞本身可以特異性表達(dá)熒光蛋白，從而省去了每次實(shí)驗(yàn)前需預(yù)先進(jìn)行細(xì)胞染色或抗體標(biāo)記的冗繁過(guò)程，提高了檢測(cè)效率；同時(shí)也避免了非特異性染色結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題，避免了共孵育前標(biāo)記靶細(xì)胞影響靶細(xì)胞功能的問(wèn)題，提高了檢測(cè)的精準(zhǔn)性。2.本檢測(cè)方法不需要放射性物質(zhì)，因此，不存在放射性污染。3.檢測(cè)時(shí)間短：本專(zhuān)利檢測(cè)方法的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)約為2-4h，而傳統(tǒng)技術(shù)（LDH釋放法、MTT比色法等）的檢測(cè)時(shí)間需要18-24h，由此可見(jiàn)，本專(zhuān)利技術(shù)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。4.由于本檢測(cè)方法靈敏度提高，因此，當(dāng)檢測(cè)血液中NK細(xì)胞的活性時(shí)，所需的采血量大大減少，并且經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的檢測(cè)方法用于檢測(cè)血液中NK細(xì)胞的活性時(shí)，抽血量?jī)H為傳統(tǒng)技術(shù)（51Cr釋放法、LDH釋放法等）的1/4，降低了白細(xì)胞缺乏患者檢測(cè)失敗率，能大幅提高NK細(xì)胞活性檢測(cè)的適用性。綜上所述，本檢測(cè)方法具有檢測(cè)全面、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、檢測(cè)效率高、樣品所需量小等諸多優(yōu)點(diǎn)。（三）技術(shù)通用性：1.介紹參評(píng)專(zhuān)利目前已應(yīng)用的領(lǐng)域和范圍；2.說(shuō)明該專(zhuān)利技術(shù)還可以應(yīng)用的其他領(lǐng)域和范圍。以上材料不超過(guò)2500字。1.目前應(yīng)用領(lǐng)域范圍：噬血細(xì)胞綜合征(HLH)是一種危及生命的高炎癥因子狀態(tài)，若不能及時(shí)診斷并給予恰當(dāng)?shù)闹委?，病死率極高。而NK細(xì)胞活性是早期確診HLH的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測(cè)定NK細(xì)胞活性的變化是診斷疾病、選擇治療方式以及隨訪療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。噬血細(xì)胞綜合征(Hemophagocyticlymphohistiocytosis,HLH)是一種以T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化的失控以及炎性細(xì)胞因子過(guò)度生成為特征的免疫紊亂狀態(tài)?；顒?dòng)期的HLH病情進(jìn)展迅速，若不及時(shí)進(jìn)行合理、有效的干預(yù)治療，死亡率極高。因此，若患者在疾病早期能夠得到及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，積極給予恰當(dāng)?shù)闹委煟梢愿纳粕?，降低病死率。HLH的病理生理基礎(chǔ)為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的下調(diào)和NK細(xì)胞功能的缺陷。NK細(xì)胞活性降低是HLH-2004診斷標(biāo)準(zhǔn)中一項(xiàng)重要的檢測(cè)指標(biāo)。Janka等發(fā)現(xiàn)原發(fā)性HLH患者在疾病早期NK細(xì)胞活性降低檢測(cè)率幾乎可達(dá)100%。另有Spessott等研究證實(shí)即使基因篩查為雜合突變也可能導(dǎo)致蛋白功能異常因而確診為原發(fā)性HLH，而這類(lèi)患者早期NK細(xì)胞活性持續(xù)降低，這些都說(shuō)明NK細(xì)胞活性的測(cè)定對(duì)早期正確診斷HLH具有重要意義。越來(lái)越多的研究認(rèn)為，體外檢測(cè)NK細(xì)胞活性是HLH診斷、選擇合理治療方式以及隨訪療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前該專(zhuān)利檢測(cè)技術(shù)已被納入《HLH診治中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)》中作為NK細(xì)胞活性的推薦檢測(cè)方法。2.其他應(yīng)用領(lǐng)域：在實(shí)際臨床應(yīng)用當(dāng)中，NK細(xì)胞活性是判定機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)功能的重要指標(biāo)之一，并可在一定程度上判定及監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。例如：在惡性腫瘤、免疫缺陷病、長(zhǎng)期使用免疫抑制劑及部分病毒、細(xì)菌和真菌感染患者中，NK細(xì)胞活性減低；在某些病毒感染性疾病的早期、長(zhǎng)期使用干擾素及其誘導(dǎo)物、習(xí)慣性流產(chǎn)及宿主抗移植物反應(yīng)者中，NK細(xì)胞活性增高。該專(zhuān)利技術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞活性的應(yīng)用可在一定程度上提高某些危重疾病的早期診斷率，及早得到有效治療，從而更好地服務(wù)于醫(yī)療及患者，使更多危重患者的預(yù)后得到改善，并從中獲益。四、社會(huì)效益及發(fā)展前景評(píng)價(jià)材料（一）社會(huì)效益狀況：詳細(xì)說(shuō)明參評(píng)項(xiàng)目對(duì)促進(jìn)技術(shù)進(jìn)步、提高科學(xué)管理水平、保護(hù)自然資源與生態(tài)環(huán)境、消除公害污染、安全生產(chǎn)、改善勞動(dòng)條件、醫(yī)療保健、保障國(guó)家和公共安全、提高人民物質(zhì)文化生活水平、引領(lǐng)消費(fèi)習(xí)慣等方面所起的作用。如能采取定量方法說(shuō)明的均需有具體數(shù)字。該項(xiàng)專(zhuān)利解決了目前用于NK細(xì)胞活性測(cè)定的各種檢測(cè)手段的局限性（包括放射性污染、白細(xì)胞缺乏失敗率高、可重復(fù)性差、判讀不精準(zhǔn)等），提高了該技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)水平，提高了診斷時(shí)效，節(jié)省醫(yī)療資源。具體如下：1.該專(zhuān)利檢測(cè)方法不需要放射性物質(zhì)及高昂的設(shè)備，因此不存在放射性污染，節(jié)省了醫(yī)療資源；2.所需采血量減少，抽血量?jī)H為傳統(tǒng)技術(shù)的1/4，降低了白細(xì)胞缺乏患者檢測(cè)失敗率，降低患者多次抽血痛苦，擴(kuò)大檢測(cè)的適用性；3