第十章吸光光度法

第十章吸光光度法

特點靈敏度高：測定下限可達10-5～10-6mol·L-1,10-4%～10-5%

準確度能夠滿足微量組分的測定要求：相對誤差2～5％（1～2％）操作簡便快速應用廣泛

吸光光度法是基于被測物質的分子對光具有選擇性吸收的特性而建立起來的分析方法。第一節(jié)物質對光的選擇性吸收一、光的基本性質光的波粒二象性波動性粒子性E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光電效應E：光子的能量（J,

焦耳）：光子的頻率（Hz,赫茲）

：光子的波長（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常數(shù)（6.625610-34J.s

焦耳.秒）結論:一定波長的光具有一定的能量，波長越長(頻率越低)，光量子的能量越低。光的電磁波性質射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光單色光、復合光、光的互補單色光復合光光的互補單一波長的光由不同波長的光組合而成的光若兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠二、物質對光的選擇性吸收（一）物質對光產(chǎn)生選擇性吸收的原因吸收光譜光作用于物質時，物質吸收了可見光，而顯示出特征的顏色，這一過程與物質的性質及光的性質有關。物質對光的吸收物質對光的吸收滿足Plank條件hS2S1S0S3E2E0E1E3hhh物質對光的選擇吸收

物質的電子結構不同，所能吸收光的波長也不同，這就構成了物質對光的選擇吸收基礎。例：A物質B物質同理，得：1ev=1.610-19J.（二）物質的顏色與光吸收的關系物質的顏色與光的關系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現(xiàn)象示意復合光（三）吸收曲線（吸收光譜）將不同波長的單色光依次通過某一固定濃度的有色溶液，測量每一波長下，有色溶液對光吸收的強度(A)，作A--λ曲線圖

吸收光譜反應了不同物質的不同特征吸收：同一物質對不同波長的光的吸收強度不同，如

KMnO4對400nm吸收少，對525nm吸收最大，稱

λmax

。(2)同一物質濃度一定時，在某波長下吸收強度一定，濃度不同吸收強度不同，c愈大，A愈大，是光譜定量的依據(jù)。

(3)同一物質分子運動的形式相同，結構相同，吸收曲線的形狀相同，且λmax位置不變

。(4)不同物質的吸收曲線形狀不同，決定了物質的結構分析的依據(jù)。

(5)若選擇在λmax處測量A，則靈敏度高。

(6)從吸收光譜曲線得出結論：c愈大，顏色愈深，吸收光愈強；c愈小，則相反。

定性分析與定量分析的基礎定性分析基礎定量分析基礎物質對光的選擇吸收ABA在一定的實驗條件下，物質對光的吸收與物質的濃度成正比AC增大第二節(jié)光吸收的基本定律一、朗伯-比爾定律透光率（透射比）透光率定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%吸光度A

(Absorbance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=—lgT

朗伯定律(1760)：

A=lg(I0/It)=k1b

當入射光的，吸光物質的c一定時，溶液的吸光度A與液層厚度b成正比。比爾定律(1852)：

A=lg(I0/It)=k2c

當入射光的，液層厚度b

一定時，溶液的吸光度A與吸光物質的c成正比。朗伯-比爾定律意義:

當一束平行單色光通過均勻、透明的吸光介質時，其吸光度與吸光質點的濃度和吸收層厚度的乘積成正比。A=lg(I0/It)=kbc吸光度A、透射比T與濃度c

的關系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20（一）朗伯-比爾定律的推導I0dbbItII-dIdI

∝NIN：薄層中的吸光粒子數(shù)N=N0cdSdbN0：阿伏加德羅常數(shù)dS

：捕獲面積，薄層中光照射的面積c：吸光溶液的濃度N=k’

cdb故

dI

∝NI=Ik’

cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb積分得或得朗伯-比爾定律的適用條件1.

單色光

應選用max處或肩峰處測定3.吸光質點之間無相互作用

稀溶液，濃度增大，分子之間作用增強。

2.吸光物質為均勻非散射體系

4.輻射與物質之間的作用僅限于光吸收過程

無熒光和光化學現(xiàn)象發(fā)生（二）吸收系數(shù)和桑德爾靈敏度1、吸收系數(shù)a和摩爾吸收系數(shù)(

)

A=K·b·c

(1)

當

c=g/L、b=cm：

K=a=L·g-1·cm-1

A＝abc(2)

當

c=mol/L、b=cm：

K==L·mol-1·cm-1

A＝

bc

影響值大小的因素

(1)入射光波長

(2)與被測物質有關(FeSCN

，k=200；

Fephen1.1×104

)

(3)溫度，酸度，介質，有色物結構

(4)不隨

c或A值變化

越大,靈敏度越高:

<104為低靈敏度

104～105為中等靈敏度

>105為高靈敏度2、桑德爾靈敏度定義：當光度檢測器的檢測極限為A=0.001則：單位截面積光程內所能檢測出來的吸光物質最低含量。用S表示，單位：g·cm-2A=bc

=0.001

bc

＝0.001/

S小靈敏度高;

相同的物質，M小則靈敏度高。變換單位:bcmcmol/L=bcM106g/1000cm2例

鄰二氮菲光度法測鐵，cFe=1.0mg/L,

b=2cm，A=0.38，計算、S解：

cFe

=1.0mg/L=1.0×10-3/55.85=1.8×10-5(mol·L-1)S=M/=55.85/1.1×104=0.0051(g/cm2)例

比較用以下兩種方法測Fe的靈敏度B、用4,7-二苯基鄰二氮菲光度法測定鐵ε533＝2.2×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(2.2×104)＝0.0025(g·cm-2)B方法比A方法的靈敏度高A、用鄰二氮菲光度法測定鐵時，ε508＝1.1×104L·mol-1·cm-1S=55.85/(1.1×104)＝0.0051(g·cm-2)[例]已知含F(xiàn)e2+12.5μg/25mL，用鄰二氮菲顯色后形成Fe(Phen)3，用2cm比色皿在λ508nm測得A=0.19，求ε=？

[解]

μg·10-6

———

12.5·10-6(g)Fe(g/mol)25

[Fe2+]=cFe=—————/

————=———

25mL1000M

——

1000=8.95×10-6mol/L

A0.19ε=——=

=1.1×104L·mol-1·cm-1

bc2×8.95×10-6(三）標準曲線的繪制及其應用繪制A-c（吸光度-濃度）曲線，得到一條通過原點的直線，即標準曲線。溶液濃度的測定A＝bc工作曲線法(標準曲線)

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx二、引起偏離朗伯

–比爾定律的因素

主要原因物理因素化學因素（一）物理因素1.非單色光引起的偏離

Beer定律應用的重要前提——入射光為單色光

照射物質的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對檢測器的響應，必須保證一定的狹縫寬度這就使分離出來的光具一定的譜帶寬度設入射光由1和2兩種波長組成，溶液的吸光質點對兩種波長的光的吸收均遵從吸收定律1

2

1+2

入射光的譜帶寬度嚴重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀結論：選擇較純單色光（Δλ↓，單色性↑）選λmax作為測定波長（Δ↓，S↑且成線性）成線性關系A與C不成線性關系，偏離比爾定律Ａ與Ｃ偏離線性關系越嚴重討論：２．非平行入射光引起的偏離３．介質不均勻引起的偏離（二）化學因素Beer定律適用的另一個前提：稀溶液濃度過高會使C與A關系偏離定律[例]Cr2O72-+H2O=2HCrO4-=2H++2CrO4-

橙色

黃色

λ1max=350nm

λmax=375nm

λ2max=450nm

化學反應引起的偏離第三節(jié)吸光光度法的儀器光度分析的幾種方法目視比色法標準系列未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準確度低（半定量）不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高光電比色法光電比色計結構示意圖通過濾光片得一窄范圍的光(幾十nm)濾光片吸收濾光片：只允許指定的窄范圍波長光通過，其他波長的光均被吸收。選擇濾光片的原則：

濾光片透光率最大的光是溶液吸收最大的光,

即濾光片的顏色與有色溶液的顏色互補。吸光光度法通過棱鏡或光柵得到一束近似的單色光。波長可調，故選擇性好，準確度高。一、分光光度計的基本部件0.575光源單色器吸收池檢測器顯示未考慮吸收池和溶劑對光子的作用分光光度計的主要部件光源：發(fā)出所需波長范圍內的連續(xù)光譜，有足夠的光強度,

穩(wěn)定?？梢姽鈪^(qū)：鎢燈，碘鎢燈(320～2500nm)

紫外區(qū)：氫燈，氘燈(180～375nm)

氙燈：紫外、可見光區(qū)均可用作光源/nm鎢燈（熱輻射光源）4006008001000氙燈（氣體放電光源）氫燈強度氙燈氫燈鎢燈單色器：將光源發(fā)出的連續(xù)光譜分解為單色光的 裝置。

棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同

玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狹縫準直透鏡棱鏡聚焦透鏡出射狹縫白光紅紫λ1λ2800600500400光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600、1200、2400條/mm)。

利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。波長范圍寬色散均勻分辨性能好使用方便－平面透射光柵－反射光柵（廣泛使用）吸收池(比色皿)：用于盛待測及參比溶液。

可見光區(qū)：光學玻璃池 紫外區(qū)：石英池信號顯示系統(tǒng)（檢流計）：檢測光電流強度的大小，并以一定的方式顯示或記錄下來。

數(shù)字顯示，自動掃描記錄檢測器：利用光電效應，將光能轉換成電流訊號。

光電池，光電管，光電倍增管光電管(Phototube)h（片）紅敏管625-1000nm藍敏管200-625nm光電倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)1個光子可產(chǎn)生106～107個電子160-700nm二、吸光度的測量原理檢測器接受比色皿透過的光強，轉換為電信號，并放大顯示，讀取T,A光量調節(jié)：調T=100%或A=0三、分光光度計的類型單波長單光束分光光度計0.575光源單色器吸收池檢測器顯示特點：使用時來回拉動吸收池→移動誤差對光源要求高比色池配對比值光源單色器吸收池檢測器顯示光束分裂器單波長雙光束分光光度計特點：不用拉動吸收池，可以減小移動誤差對光源要求不高可以自動掃描吸收光譜雙波長分光光度計

特點：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差光源單色器單色器檢測器切光器狹縫吸收池第四節(jié)吸光光度法分析條件的選擇一、顯色反應及其條件的選擇（一）顯色反應和顯色劑

顯色反應的選擇

靈敏度高，一般ε>104;選擇性好;顯色劑在測定波長處無明顯吸收；對照性好,

max>60nm;反應生成的有色化合物組成恒定，穩(wěn)定;顯色條件易于控制，重現(xiàn)性好。

顯色劑分類

1.無機顯色劑

SCN-→Fe3+，MoV

，Co2+

MoO42-→Si，P，V，Ge，As

H2O2→Ti→TiO(H2O2)2+

黃

2.有機顯色劑

生色團：分子中含不飽和鍵基團，吸收波長

λ>200nm的光

–N=N–;C=O；C=S;–NO2;–N=O

助色團：含有孤對電子的基團，與生色團上的不飽和鍵作用，影響化合物對光的吸收，使顏色加深。

–NH2

；RNH–；R2N–；–OH：：：：助色團－NH，－OH，－X（孤對電子）neO生色團：－N＝N－，－N＝O，OC=S,－N（共軛雙鍵）πe有機顯色劑CH3－C－C－CH3HO－NN－OH＝＝NNOHCOOHSO3HOO型：NNNOH

OHON型：PARNHNHNSNS型：雙硫腙NN型：丁二酮肟鄰二氮菲磺基水楊酸（二）顯色反應條件的選擇c(R)c(R)c(R)1.顯色劑的用量（c、pH一定）Mo(SCN)32+

淺紅Mo(SCN)5

橙紅Mo(SCN)6-淺紅用量范圍寬用量范圍窄嚴格控制顯色劑量2.溶液的酸度酸度的影響對顯色劑濃度和顏色的影響M+nR=MRnOH-H+存在型體的變化RH=R-

+H+

12生成不同配比的絡合物例，磺基水楊酸–Fe3+pH=2~3FeR紫紅色pH=4~7FeR2橙色pH=8~10FeR3黃色實際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。pHpH1<pH<pH2溫度的選擇實際工作中，作A~T

曲線，尋找適宜反應溫度。ATATATATAT反應時間的選擇實際工作中，作A~t

曲線，尋找適宜反應時間。3.時間和溫度另外，還有介質條件、有機溶劑、表面活性劑等。4.共存離子的干擾及消除

(1)控制酸度，利用酸效應提高選擇性

(2)加入掩蔽劑

(3)利用氧化還原反應，改變干擾離子價態(tài)

(4)分離干擾元素

(5)利用參比液消除顯色劑、試劑帶入的干擾

(6)選擇適當?shù)臏y量波長

Co2+,Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2(藍)⑴NaFSCN－Co2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCN－測Co2＋

:(掩蔽法)化學法

Co2+,Zn2+,Ni2+,Fe2+

CoR,ZnR

NiR,FeRCoR,Zn2+

,Ni2+

,Fe2+

鈷試劑RH+測Co2＋

:(生成絡合物性質不同)消除干擾，也可采取分離法。Fe3+,Cu2+FeSSal（紫紅）Cu2+pH=2.5SSal測Fe3＋:(控制pH)物理法—選擇適當?shù)臏y定波長515655415500釷-偶氮砷III

鈷-亞硝基紅鹽

AA絡合物絡合物試劑試劑/nm/nm二、吸光光度法的測量誤差及測量條件的選擇100806040200T/%

c1

c2

c3

T

T

T-透光率讀數(shù)誤差

cc1c1c2c2c3c3><

由于T與濃度c不是線性關系，故不同濃度時的儀器讀數(shù)誤差T

引起的測量誤差c/c不同。（一）儀器測量誤差檢測計標尺上A與T的關系若測A時產(chǎn)生微小的絕對差dA，則相對誤差Er為：Er=dA/A；A=εbc，當b一定時，兩邊積分得：dA=εbdcdc為測量濃度時的絕對誤差，二式相除：

dA/A=dc/c=Er

因CA，故dc亦正比dA測量誤差公式推導:dA

=d(-lgT)=d(-0.434lnT)=-0.434dT/TA=-lgTTlgT

最大時，即(TlgT)′=0時誤差最小,

算得lgT=-0.434,T=36.8%，A=0.4341086420204060800.70.40.20.1AT/%Er(36.8)0.434濃度測量的相對誤差與T(或A)的關系實際工作中，應控制T在10～70％,

A在0.15～1.0之間(調c,b,)（二）測量條件的選擇

1.測量波長的選擇：最大吸收的原則λmax

2.控制吸光度讀數(shù)范圍：調

c或b，使A介于

0.2----0.8之間。

3.參比溶液的選擇:選合適的參比溶液,調儀器

A=0，T=100%。

1.僅絡合物有吸收，溶劑作參比。

如phen—Fe2+

標準曲線2.待測液也有吸收，被測液作參比。

如測汽水中的Fe3.顯色劑或其他試劑也有吸收，空白溶液作參比

例:鄰二氮菲光度法測Li2CO3中的Fe，

參比溶液為不含Li2CO3樣品的所有試劑。4.干擾組分與顯色劑有反應,又無法掩蔽消除時：

1）掩蔽被測組分，再加入顯色劑，作參比.2）加入等量干擾組分到空白溶液中,作參比.

--選擇適當?shù)膮⒈热芤旱谖骞?jié)吸光光度法的應用一、定量分析（一）單組分的測定

1）選擇合適的顯色反應和顯色條件

2）繪出被測組分的吸A

收光譜曲線(用標液)3）在λmax下測一系列標準溶液λ

的A值，繪制工作曲線A---c4）與工作曲線相同的方法，測未知物AX

，從工作曲線上查

cX

Ax

Cx1.一般方法2.示差分光光度法原理：以稍低于待測組分濃度的標準溶液作為參比溶液，然后測試液的吸光度，再從A求c，從而提高準確度。參比液cS<cX樣品液

(co<cX)

則AS=εbcSAX=εbcX

A=△A相對=AX-AS=εb(cX-cS)=εb△c相對用cS參比液調“0”，而后測A值，實際是試樣與參比之差△A與兩者的濃度差△c成正比故：cX=cS+△cX

方法比較常規(guī)法以空白溶劑為參比示差法以濃度為Cs

的標準溶液為參比A△C△CxA′常規(guī)法TxT051050100

落在測量誤差較大的范圍示差法T051050100TrTsTs

落在測量誤差較小的范圍結論：示差法通過提高測量的準確度提高了方法的準確度（二）多組分的同時測定

xl1,eyl1,exl2,eyl2由x,y標液在1,2處分別測得在1處測組分x,在2處測組分yb)在1處測組分x;在2處測總吸收,扣除x吸收,可求yc)x,y組分不能直接測定

A1=exl1bcx+eyl1bcy(在1處測得A1)

A2=exl2bcx+eyl2bcy(在2處測得A2)二、絡合物組成和酸堿解離常數(shù)的測定（一）絡合物組成的測定1.摩爾比法:

固定cM

，改變cR

1:13:1c(R)/c(M)A1.02.03,0

M+nR=MRn2.等摩爾連續(xù)變化法:M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:200.20.40.60.8100.20.40.60.81M+nR=MRn條件穩(wěn)定常數(shù)的測定00.51.0ACM/CA′A′<A0由于絡合物離解引起離解度MR=R+M總濃度c平衡濃度c(1-a